中药注射剂过敏类反应研究思路范文
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中药注射剂(traditionalchinesemedicineinjection，TCMI)引发的药物不良反应是限制其使用的重要因素，据统计，被列入中国国家基本药物目录(2004版)中的33种TCMI均有临床不良反应事件发生，其中过敏反应占75%，具体表现为皮肤瘙痒，各种过敏性皮疹，粘膜水肿等，且具有不良反应发生时间较早，累及多器官，涉及多品种的特点［1］。由于其临床表现符合Ⅰ型超敏反应的主要特点，早期多认为TCMI所引发的过敏反应属于Ⅰ型超敏反应，所以在探索过敏原或建立检测模型的过程中，多使用以Ⅰ型超敏反应机制为基础的实验模型。例如，我国《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中对TCMI过敏反应的检测要求为，全身主动过敏试验(activesystemicanaphylaxis，ASA)和皮肤被动过敏试验(passivecutaneousanaphylaxis，PCA)，这2种实验均是以Ⅰ型超敏反应的相关机制为基础［2］。而后续有研究发现，在TCMI的动物实验中，双黄连注射液及鱼腥草注射液等被认为首次给药就容易出现临床过敏反应的注射剂，能够引发动物的类过敏反应，因此认为，TCMI引发的不良反应类型实际上为类过敏反应(anaphylactoidreaction)［3-4］。同样，对青霉素引发临床过敏反应的研究也是如此。早期认为青霉素引发的过敏类反应属于典型的Ⅰ型超敏反应，但后续研究发现，仅不到10%被确诊为真正的过敏反应，许多声称对青霉素过敏的人，并没有在体内检测到IgE抗体，同时皮试结果为阴性。有研究发现，某些β内酰胺引起的过敏反应并不是传统意义上的免疫学反应，而是一种剂量依赖的反应，通过非免疫学的途径同样能够引起组胺等其他炎症物质的释放从而引发相关反应，这种反应即为类过敏反应［5-7］。基于上述相关研究，本文介绍了I型超敏反应和类过敏的一般原理、及目前研究常用的实验方法，同时总结了3种临床报道较多的，TCMI的过敏类反应的研究进展，希望能为TCMI过敏类反应的全面性提供参考。
1超敏反应
1.1超敏反应的一般原理
药物过敏反应按照其发生机制可以分为4类，包括:Ⅰ型/速发型超敏反应，主要由药物特异性IgE抗体所介导;Ⅱ型/溶细胞或细胞毒性超敏反应，由药物特异性IgG抗体或IgM抗体介导;Ⅲ型/免疫复合物型，同样由药物特异性IgG抗体或IgM抗体介导;Ⅳ型/迟发型，由药物特异性T细胞介导［8］。药物过敏反应的另一分类方式由Levine于1996年提出的，基于给药时刻和症状产生时刻的间隔时间的长短来分类，包括速发型、加速型和迟发型3类。这一分类方式随后被简化为速发型(间隔时间≤1h)和非速发型(间隔时间＞1h)2类［9］。以上这2种分类方式也常联合使用，一般认为Ⅰ型速发型超敏反应即速发型是由IgE介导的，其余3类反应则属于非速发型反应。根据上文提到TCMI过敏反应发生时间较短的特点，此处主要讨论Ⅰ型超敏反应。Ⅰ型超敏反应的一般机制包括致敏和激发效应2部分内容。在致敏阶段，IgE的产生决定着Ⅰ型超敏反应的发生和发展。致敏阶段的初期，B细胞中发生偏向IgE的类别转换是IgE水平增加的直接原因。这一过程受树突状细胞(DC)和T细胞的共同调节，其中Th2细胞发挥主要作用，整体表现为变应原特异性Th1和Th2细胞平衡失调。DC作为抗原提呈细胞首先和IgE特异性的变应原结合，将其抗原决定簇提呈给T细胞，特异性CD4+T细胞随之而产生的刺激导致T细胞产生并释放白介素-4(IL-4)，以及T细胞表面CD40配体表达水平的上调(CD40L)。变应原特异性B细胞上CD40的激活，导致其表面共刺激分子CD80和CD86表达水平上调，从而使更多效应T细胞表达CD40L同时通过IL-4诱导增强对B细胞的刺激。CD40介导的对B细胞的刺激与IL-4受体信号协同，增加Cε基因转录同时激活诱导胞嘧啶核苷脱氨酶，使IgE基因组位点发生重排并产生IgE抗体。该类IgE抗体具有嗜细胞性，迅速通过肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和性的IgEFc段受体{(FCεRⅠ)}与之结合，在变应原和效应细胞间建立功能联系。当机体再次接触变应原，变应原特异性识别肥大细胞/嗜碱性粒细胞表面IgE抗体，与之结合，引发细胞脱颗粒反应，释放组胺、缓激肽等储备介质和白三烯(LTs)、前列腺素D2(PGD2)、血小板活化因子(PAF)等新合成的物质，引发机体平滑肌收缩，毛细血管扩张，通透性增加，腺体分泌增加，从而在不同水平不同部位引发不良反应，包括全身性的过敏休克、呼吸系统相关的过敏性哮喘和鼻炎、消化系统相关的过敏性胃肠炎及皮疹等［10-11］。Ⅰ型超敏反应发生的机制提示在研究TCMI所致过敏反应机制及确证过敏原时，可关注的阶段包括:(1)致敏阶段，Th2细胞、抗原提呈细胞(主要为DC)及B细胞表面与B细胞发生偏向IgE类别转化的细胞标志物水平的变化，及相关细胞因子水平，代表有CD40L、CD40和IL-4;(2)抗原特异性IgE抗体水平及血清总IgE抗体水平;(3)及激发后肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒所释放的活性物质的浓度变化。
1.2研究Ⅰ型超敏反应常用实验技术
现有常用于研究TCMI过敏原的实验模型包括:《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中收录的豚鼠的全身主动过敏模型、大鼠、小鼠或豚鼠被动皮肤过敏试验动物模型，以及大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3)模型［2-12］。研究Ⅰ型超敏反应时常用的观察、检测指标包括:(1)全身主动过敏试验模型中，动物行为学的改变，如:按照过敏反应症状评价标准评价动物是否出现过敏反应及反应程度［9］;(2)病理切片观察，如注射用双黄连与生脉注射液对Hartley豚鼠与BN大鼠ASA影响的研究中，在激发后将动物处死，苏木素－伊红(HE)染色观察肺组织是否出现淋巴细胞浸润等炎症病理表现［13］;(3)IgE抗体检测:IgE抗体作为参与Ⅰ型超敏反应的代表性抗体，其血清水平的检测也是Ⅰ型超敏反应研究过程中的关键内容。现多选用ELISA试剂盒对其含量进行测定［14-15］。RBL-2H3细胞是由Leonard等［16］在1973年从Wistar大鼠中首次分离得到的嗜碱性白血病细胞株，应用于体外特异性抗体IgE与细胞表面的高亲和力FcεRI受体结合后下游事件研究，其胞质内含有丰富的嗜碱性颗粒，当被激活时，可释放组胺、β-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶等物质［17］。
2类过敏反应
2.1类过敏反应的一般原理
对药物超敏反应深入研究发现许多临床所使用的药物在进入人体后，无潜伏期，也无变应原特异性IgE抗体的产生，且无抗原与抗体特异性结合的过程，迅速引发与Ⅰ型超敏反应相同的临床表现，Dukor［18］将之称为类过敏反应。这类反应和Ⅰ型超敏反应的临床表现完全相同，最大的区别就是血清中检测不到变应原特异性的IgE抗体［19］。现在研究认为类过敏反应的机制主要包括2类［20］，一是变应原直接刺激嗜碱性粒细胞或肥大细胞释放生物活性介质，该过程基本符合Ⅰ型超敏反应激发效应阶段的相关机制;二是变应原通过激活补体系统间接刺激嗜碱性粒细胞或肥大细胞释放生物活性介质。补体活化包括经典途径、甘露糖结合凝集素途径和旁路途径3个主要途径［21-22］。类过敏反应的发生主要与激活旁路途径相关。变应原作为一种外源性的异物颗粒与血清中自发产生的C3b结合，并随后与单链B因子在D因子的作用下，将B因子裂解为Ba和Bb，Bb与C3b结合形成C3bB的复合物，并与P因子结合形成C3bBP复合物，即C3转化酶，该复合物能够再次作用于C3将其水解为更多的C3a和C3b，多个C3b沉积于颗粒表面，形成C3bBb3b复合物，即旁路途径的C5转化酶，从而裂解C5产生C5a和C5b。而产生C3a、C5a可与其MC/BAS表面受体结合进而导致MC脱颗粒而产生速发型变态反应症状。类过敏反应发生的机制提示在研究TCMI所致类过敏反应机制及确证变应原时，关注的问题包括(1)激发后肥大细胞脱颗粒所释放的活性物质的浓度变化;(2)补体水平的测定;(3)血清IgE抗体测定，该指标的测定主要是为了与Ⅰ型超敏反应进行区分。
2.2研究类过敏反应常用实验技术
现有研究常用TCMI类过敏反应的实验模型包括:肥大细胞脱颗粒模型(RBL-2H3与P815细胞系、体外模型)、Beagle犬类过敏模型(动物模型)、以及与皮肤血管渗透性改变相关的类过敏模型(动物模型)，如，对试验动物一次性静脉注射含0.4%伊文思蓝(EB)的相应受试物，随后记录各组动物耳廓蓝染数，进行耳廓蓝染程度评分［23］。同样，P815细胞作为一种细胞模型，也常常用于类过敏实验的体外研究［24］。研究Ⅰ型超敏反应时常用的观察、检测指标包括:(1)利用动物模型进行试验时，类似于Ⅰ型超敏反应，通过最终观察动物行为学的改变，如:按照类过敏反应症状评价标准评价动物是否出现过敏反应及反应程度［25］;(2)在与皮肤血管渗透性改变相关的类过敏模型中，通过最终观察记录，比较血管渗透性改变的程度，来确定动物发生类过敏反应的情况［25-26］;(3)实验动物一次静脉注射测试药物，ELISA检测给药后血液中类过敏反应特征细胞因子，包括组胺、类胰蛋白酶水平和补体各项指标等［25-27］。P815细胞来源于小鼠的肥大细胞系，具有肥大细胞的生物学特性，许多研究表明P815可被C48/80激活发生脱颗粒，并释放组胺、白介素和前列腺素等物质，被广泛的应用于筛查变应原和免疫毒性机制研究［28］。类过敏反应的最终临床表现和Ⅰ型超敏反应相同，均是由肥大细胞脱颗粒释放组胺等炎症因子在不同组织器官所引起的不良反应，故其在动物模型中所引发的行为学改变应是一致的，包括在病理切片中所显示出的改变也应基本一致。二者主要的区别体现在Ⅰ型超敏反应致敏后体内IgE水平的升高，而类过敏反应中则不存在此过程。
3中药注射剂过敏类反应机制的研究进展
根据国家药品不良反应监测年度报告(2016年)显示，2016年药品不良反应/事件报告中，涉及怀疑药品150.7万例次，中药占16.6%，其中按药品给药途径分布，静脉注射给药占53.2%，其他注射给药占0.6%，口服给药占40.2%，其他给药途径占6.0%，与2015年相比，总体给药途径分布无明显变化。且从报告涉及剂型与给药途径看，TCMI占比较高，从药品类别上看，主要涉及活血化瘀类、清热解毒类、益气养阴类和凉开类TCMI［29-30］。双黄连注射剂、清开灵注射剂和鱼腥草注射液作为其中最常见引发过敏反应，也是其中被研究最多的几种注射剂［31］。而吐温－80作为TCMI中常见的助溶剂，也有大量报道证明其是引起TCMI过敏类反应的重要因素。
3.1关于绿原酸致敏性的相关研究
上述3种常见的中药注射剂均属于清热解毒类，临床应用率较高，同时发现其均含有绿原酸(Chlorogenicacid，CA)。CA广泛存在于多种TCMI，近几年对其致敏性的研究日益增多，其是否有致敏性问题引起争论。早在10世纪60年代，Freedman与Layton研究小组分别对CA的致敏性研究发表了一系列文章，持相反观点并展开了激烈争论。Freedman和Bariana等［32-33］发现绿咖啡豆的水提取液高度致敏，通过对组分分析发现CA可能是主要过敏原，通过进一步研究，推测CA作为半抗原与人体内蛋白质结合而产生致敏活性。另一方面，Layton等［34］通过纯化手段，临床实验及动物实验发现CA不是过敏原，而是其粗提取物中的大分子物质。国内的研究主要关注与TCMI中CA的潜在致敏性，吴晓冬等［35］采用ACA和PCA对不同纯度的CA提取物致敏试验发现，CA没有致敏原性，而低纯度提取物中存在的大分子物质与致敏反应密切相关。而何洲等［36］在体外将CA与牛血清蛋白合成人工抗原免疫昆明小鼠，CA抗体IgG检测呈阳性，ACA试验中小鼠均出现不同程度的过敏反应，认为CA可以作为一种半抗原刺激小鼠产生免疫应答并引发过敏反应。对于TCMI中CA是否是过敏原仍存在争议，需采用敏感有效的体内外模型进行深入的探究。
3.2关于吐温80致敏性的相关研究
近年来，针对TCMI过敏机制的各种试验研究模型和方法，主要被分成了2大类，前期如同上述对CA的研究，主要以过敏反应的一般原理为依据，采用多次致敏的试验技术，而随后，由于一些物质在一型超敏反应的模型中并未出现阳性反应，但在临床应用中却出现类似一型超敏反应的症状，且随着免疫学的进一步发展，有研究开始以类过敏反应的一般原理为依据，采用单次给药手段进行研究。孙伟伟等［37］在研究吐温80及其配置的鱼腥草注射液的过敏反应试验中豚鼠过敏反应模型多次给药的方式，评价药物对豚鼠的敏感性，并得到了豚鼠血浆IgE水平升高，动物出现典型过敏反应的阳性结果。而在罗霞等［38］人以典型类过敏反应研究细胞RBL-2H3对吐温-80与过敏反应关系得到，也吐温-80可引起RBL-2H3细胞脱颗粒释放炎症介质存在剂量关系的阳性结果;且刘婷等［3］采用Beagle犬类过敏反应模型评价吐温-80及其配置的鱼腥草注射液时，也得到了明显的阳性结果，该研究还发现吐温-80的致敏反应与补体激活有关。
3.3关于双黄连注射液致敏性的相关研究
另外，对双黄连注射剂所引发的过敏反应则集中在类过敏反应中，易艳等［39］通过小鼠耳廓蓝染实验证明双黄连注射液在在临床等效将和2倍剂量小有明显增高细血管通透性的作用，即存在致类过敏反应的作用;程芳等［26］人在对注射用双黄连的研究中发现，其导致的急性过敏反应可能主要为类过敏反应，其主要发生机制可能为通过释放组胺和类胰蛋白酶等生物活性介质导致机体多系统产生毒性反应，且双黄连本身也可能含有具有类组胺效应的成分，在血压下降等症状的产生过程中发挥作用;该研究同时采用Wistar大鼠多次致敏模型对其进行评价时得到阴性结果，且血清IgE水平与生理盐水对照组比较差异无统计学意义，提示双黄连注射液所产生的过类性反应可能单纯是类过敏反应。而从上述关于鱼腥草注射液及吐温-80的研究结果中可以看出，该类制剂所引发的过敏类反应的机理可能同时包括类过敏和Ⅰ型超敏反应。上述内容提示，在对TCMI进行安全性评价时，不能仅考虑其可能引发Ⅰ型超敏反应，同时也要关注其引发其他超敏反应的可能性。另外，虽然TCMI出现多品种多发过敏性不良反应的情况，但就其过敏反应的机制及过敏原物质基础的研究，却相对较少深入展开，现有的主要研究均集中在上述品种。
4总结
基于TCMI引发过敏反应的一般临床症状及特点，目前普遍认为其反应类型属于Ⅰ型超敏反应，近年来，有研究提出其发生机制可能符合类过敏反应一般规律。通过研究Ⅰ型超敏反应及类过敏反应的基本的机制，可以发现，二者最明显的区别就是血清IgE水平和抗原特异性IgE水平的变化，即在Ⅰ型超敏反应中，存在由免疫系统所介导的致敏过程，只有当过敏原二次与机体接触后才能引发相关反应，而类过敏反应的发生则无需免疫系统介导，在过敏原物质首次接触机体后就可以发生。这一点的测定可以在实验早期帮助区分致敏原的根本性质，指导临床用药。而对其过敏原的确证和作用机制的明确，能更好的认识TCMI不良反应的本质，从而找到更好的解决中药注射剂不良反应的方法，保障安全用药。此外，无论是早期对青霉素过敏性反应的研究，还是后来对TCMI的过敏性反应的相关研究，都存在Ⅰ型超敏反应和类过敏反应2种结论。基于这一特点，本文提出了一种新的假设，既然对一种药物或物质引发不良反应的机制探索中，同时存在了2种可能的结论，那么一种物质是否能够同时引发这2种反应呢?现有的研究资料通常都没有关注这一事实，将2种反应割裂开研究，而针对上述出现的现象，建议，或许未来的研究中，对于同一种物质可同时建立2类反应的动物或细胞模型，更加全面的展开相关研究。
作者：范潇予1；林琳1；魏金锋1，2；靳洪涛1，2 单位：1.中国医学科学院药物研究所新药安全评价研究中心，2.北京协和建昊医药技术开发有限责任公司
