姜黄素对直肠癌放疗的作用范文

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《中华中医药学刊杂志》2014年第六期

1实验方法

1．1细胞培养人直肠癌HR8348细胞培养于含10%小牛血清的DMEM高糖培养基中，并置人37℃、5%CO2孵箱中常规培养。每2～3d传代1次，细胞贴壁生长，胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

1．2实验动物饲养BAIB/C荷瘤裸鼠饲养于浙江中医药大学实验动物中心，饲养条件为超净生物(SPF)层流架内，保持恒温(25±2)℃、恒湿(45%～50%)，笼具、垫料、饲料及饮水均经高压蒸气灭菌，每日保持10h光照、14h无光的明暗周期。对裸鼠实验室及饲养环境定期严格紫外线消毒，实验操作均在无菌罩内进行。

1．3体外实验①实验分组将人直肠癌HR8348细胞分为对照组(给予DMSO液);姜黄素组(给予2．5μM姜黄素);照射组(单纯X线照射);联合组(给予2．5μM姜黄素，联合X线照射)。②细胞毒实验(MTT法):取指数生长期HR8348细胞制成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔200μL，每组细胞接种5个复孔，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，待细胞贴壁后，去掉培养液取出，分设4组见上，4h后姜黄素联合放疗组、放疗组分别予4Gy、6Gy、10Gy放射线照射(剂量率2．0Gy/min)，继续置培养箱中培养24h后将其从培养箱中取出，再加入MTT20μL/孔(浓度为5mg/mL)，37℃、5%CO2培养箱放置4h后终止培养;吸弃各培养孔内的上清液，于每孔加入150μL的二甲基亚砜，震荡摇匀，37℃放置2h，在全自动酶标仪上以波长490nm测各孔吸光度OD值。细胞抑制率IR(%)=(对照组OD值－实验组OD值)/对照。实验重复3次。③细胞凋亡检测:根据以上实验分组每组4个平行管，待细胞贴壁后，更换培养基，姜黄素组、姜黄素联合放疗组加入姜黄素2．5μΜ，放疗组加入等量生理盐水震荡混匀，继续置培养箱中培养。直线加速器常温下照射(剂量为10Gy，剂量率为2．0Gy/min)，将四组细胞经放射线照射24h和48h后，消化，离心，用490μLPBS重悬，加入5μLAnnexinV－FITC及5μLPI(浓度250μg/mL)，混匀置室温暗处孵育30min，PBS洗2遍，流式细胞仪上机检测，AnnexinV/PI标记法检测细胞凋亡。实验重复3次。

1．4体内实验①动物肿瘤模型的制备:复苏人直肠癌HR8348细胞，用含l0%小牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃含5%二氧化碳混合气体的细胞培养箱中培养，取指数生长期的HR8348细胞经胰酶消化分散后，PBS洗涤2次，2000r/min离心5min，重悬于PBS中，制备细胞浓度为2×107/mL，取100μL(2×105个细胞/只)分别接种于裸鼠右后下肢皮下，SPF环境下饲养，待瘤体直径约5～8rnrn时进行治疗实验。观察接种部位液体吸收、肿瘤生长过程及裸鼠状况。每周用游标卡尺测量瘤体长径(a)和短径(b)，待裸鼠皮下移植瘤生长两周时随意将裸鼠分组。②实验分组及治疗方法:取BALB/C模型裸鼠64只，5周龄，18～22g，雄性，随机分为4组，每组16只，各组肿瘤体积无显著差异。对照组(等量生理盐水处理)，姜黄素组(接受姜黄素腹腔注射20mg/kg，共1次);照射组(单纯给予瘤床放射治疗，放疗总剂量10Gy，剂量率为2．0Gy/min);联合组(腹腔注射姜黄素20mg/kg，共1次。同时对小鼠瘤床进行放疗总剂量10Gy，剂量率为2．0Gy/min)。③生长延缓测定:自照射之日起每3天测量一次肿瘤的长径短径，通过下列公式来计算肿瘤体积:肿瘤体积=(a×b2)/2，a为瘤体的长径，b为瘤体的短径。取均值，绘制肿瘤体积变化曲线。裸鼠动物治疗结束后拉颈处死，剥离瘤体，每组中取部分瘤组织做快速冰冻切片，观察肿瘤组织荧光表达情况。④细胞凋亡检测:用原位末端转移酶标记技术细胞凋亡。将各组裸鼠肿瘤石蜡切片脱蜡至水，用二甲苯浸洗2次，每次5min;用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3min;滴加20μg/mL蛋白酶K，21～37℃作用15～30min;PBS漂洗2次;将酶液和标记液按1∶9比例配置成TUNEL反应液(冰浴上操作)，将反应液滴加于切片上，置于37℃恒温箱避光孵育60min。并做阴性及阳性对照;PBS洗涤，滴加POD转化液后，置于37℃恒温箱孵育30min;PBS洗涤，DAB显色，复染细胞核，脱水透明，中性树胶封片。计算各组细胞凋亡指数。

1．5统计学分析实验所得数据应用SPSS17．0软件进行方差分析，各组数据采用x珋±s表示，组间率的比较采用卡方检验，计数资料比较采用两样本t检验，多样本LSD－t检验，以P＜0．05为有统计学意义，P＜0．01为显著性差异。

2结果

2．1药物姜黄素浓度的确定我们预实验在经姜黄素处理人直肠癌HR8348细胞显示24h后，HR8348细胞增殖受到抑制。24h后1μM、3μM浓度的其生长抑制率分别为(1．9±0．3)%、(4．7±0．5)%。结合参考其他文献，根据放疗增敏剂的筛选原则［1］，在随后的实验中我们选用低药物浓度的姜黄素均为2．5μmol/L。

2．2体外实验

2．2．1MTT法检测各组肿瘤细胞的生长抑制情况给予2．5μmol/L姜黄素处理，MTT法检测细胞生长抑制情况见插页Ⅲ图1:在不同剂量X射线作用后对照组与姜黄素组细胞生长抑制率没有明显变化，照射组细胞生长抑制率呈逐渐上升趋势，联合组细胞生长抑制率上升较照射组快。与对照组，黄素组，照射组比较，联合组细胞抑制率及凋亡率明显高于对照组，姜黄素组及照射组(P＜0．05)。

2．2．2AnnexinV－PI双染法检测各组肿瘤细胞的凋亡情况插页Ⅲ图2显示AnnexinV－PI检测细胞凋亡情况，经10GyX射线作用后，24h、48h两个时间点检测到的各组细胞凋亡情况显示:24h与对照组凋亡率6%相比，姜黄素组凋亡率分别为4%、单纯照射组17%、联合组33%;48h与对照组凋亡率9%相比，姜黄素组凋亡率分别为11%、单纯照射组29%、联合组42%。对照组及姜黄素组的细胞凋亡率无显著性差异(P＞0．05)，照射组和联合组的细胞凋亡率均明显高于对照组及姜黄素组，有显著性差异(P＜0.01)，联合组的细胞凋亡率高于照射组细胞凋亡率(P＜0．05)，说明姜黄素可以显著增加HR8348细胞的放射敏感性。

2．2．3姜黄素对裸鼠瘤体生长延缓的作用所有裸鼠均接种成功，1周左右可见皮下肿瘤形成，接种后2周左右肿瘤直径达0．6～0．8cm。裸鼠瘤体的生长曲线见插页Ⅲ图3:6d以后可以看出对照组及姜黄素组肿瘤的生长明显快于其他两组，照射组与联合组间无明显差异;9d以后可以看出对照组肿瘤的生长明显快于其他3组，姜黄素组和照射组肿瘤生长明显快于联合组;15d以后对照组与照射组、姜黄素组、联合组间均有显著性差异(P＜0．01)，照射组和姜黄素组与对照组间均有显著性差异(P＜0．01)。联合组与照射组间有统计学意义(P＜0．05)。

2．2．4TUNEL法检测细胞凋亡TUNEL法检测细胞凋亡见插页Ⅲ图4:阴性对照组偶可见凋亡细胞;姜黄素组中凋亡细胞数量少;照射组中凋亡细胞增多;联合治疗组尤为明显，细胞凋亡最多。经多个样本均数间每两个均数比较的q检验，姜黄素组、照射组、联合组与阴性对照组凋亡率比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)，联合组与阴性对照组凋亡率比较，二者之间显著性差异，具有统计学意义(P＜0．01)，联合组分别与姜黄素组及照射组凋亡率比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。

3讨论

直肠癌术后局部复发是治疗失败的主要原因，经过综合治疗，直肠癌根治性切除术后5年生存率在60%左右，早期直肠癌术后的5年生存率可达80%～90%［2－3］。放疗目前已成为直肠癌综合治疗中的重要措施，美国NCCN(NationalComprehensiveCancerNetwork)公布的进展期直肠癌治疗指南中，推荐使用PRT(Preoperativeradiotherapy)。有数据表明，体内肿瘤是由于体内稳态的调控机制失控而发生，这一调控机制是通过细胞凋亡来实现的。放化疗其疗效均主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现，大量研究表明，射线作用于肿瘤细胞引起各种损伤而导致细胞死亡的主要机制是诱导细胞凋亡［4］。促使肿瘤G1/S期细胞进入并停留在G2/M期，是提高肿瘤放射敏感性的一个重要途径［5］。姜黄Cur(curcuma)是我国国粹中药，由于其作用靶点多，自身不良反应少，在逆转耐药的同时有杀伤肿瘤细胞、调节和提高机体免疫功能的多重功效，其逆转肿瘤多药耐药的作用已日益引起人们的重视。SantoshK．Sandur［6］等研究表明，姜黄素对结肠肿瘤细胞放疗具有增敏作用，其机制可能与抑制NF－κB蛋白质磷酸化有关。曹璋［7］等人的实验也证实姜黄素可通过将鼻咽癌的细胞周期阻滞在G2/M期而起到放射增敏作用。美国国立肿瘤所已将其列为第三代癌化学预防药［8］。研究发现，姜黄素可抑制多种肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡;尤其在抗肿瘤同时，能提高患者免疫力［9－10］不损害正常体细胞，其引起肿瘤细胞凋亡的机制可能与其下调NF－κB活性，调节下游凋亡调控基因Bcl－2/Bax的表达有关。本研究通过MTT实验表明，姜黄素对Hr8348细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈明显的量效和时效关系，根据我们预实验结果及放疗增敏剂的筛选原则，选取对细胞生长抑制率≤5%的低药物浓度(2．5μmol/L)作为研究姜黄素放疗增敏的最佳药物浓度，结果显示:①体外实验:照射组、联合组肿瘤细胞抑制率及凋亡率均明显高于对照组，联合组高于照射组(P＜0．05);②体内实验:观察对照组、姜黄素组、照射组及联合组的肿瘤生长曲线，结果表明姜黄素组注药第3d开始瘤体呈缓慢生长趋势;与对照组比较差异无显著性(P＞0．05)，6d以后可以看出对照组、姜黄素组肿瘤的生长明显快于其他2组，15d以后对照组、姜黄素组、照射组肿瘤生长明显快于联合组，联合组与对照组、姜黄素组、照射组比较，瘤体生长缓慢明显，差异均有统计学意义(P＜0．05);联合组与阴性对照组凋亡率比较，二者之间显著性差异(P＜0．01)，联合组与照射组凋亡率比较(P＜0．05);究其原因，我们认为单独姜黄素组抑制肿瘤作用有限，但配合放疗起协同作用，有一定的放疗增敏作用。近年来，对姜黄素的抗癌作用的实验表明姜黄素可抑制体内、外肿瘤细胞的生长［11－12］，姜黄素可使肿瘤体积及重量均明显受到抑制［13］。考虑姜黄素自身的抗癌作用，我们实验选用低剂量的姜黄素以排除高剂量姜黄素自身对肿瘤的影响，本实验显示姜黄素可诱导肿瘤细胞凋亡，配合放疗可增加放射敏感性，是方法简单且经济的治疗模式。但低剂量姜黄素配合放疗对人直肠癌肿瘤细胞株生长和凋亡的影响方面的研究目前国内外还鲜有报道，我们的探索尚处于起步，需要进一步的深入研究。

作者：陆新建裘建明杨关根王幸封巍沈忠单位：兴化市人民医院