论小儿消食片遗传毒性评价范文

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摘要:目的对小儿消食片遗传毒性进行评价。方法通过中国仓鼠肺细胞体外染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，进行小儿消食片遗传毒性研究。结果3个试验结果均判定为阴性。结论在本试验条件下，小儿消食片未发现潜在的遗传毒性，安全性良好。

关键词:小儿消食片;遗传毒性;中国仓鼠

肺细胞体外染色体畸变试验;小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验;鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验小儿消食片是《中国药典》收录品种，有消食化滞、健脾和胃的功效，用于食滞肠胃所致积滞，症见食少、便秘、脘腹胀满、面黄肌瘦等症［1］，由山楂、炒麦芽、六神曲(炒)、炒鸡内金、槟榔、陈皮组成，均是经典的儿科消食化积类药材。其中，槟榔为佐药，归脾、胃、大肠经［2］，功效行气健脾，槟榔碱是其主要有效成分［3］，有拟胆碱作用，可用于驱虫、神经系统［4］、心血管系统［5］、消化系统［6］、内分泌系统等方面［7］，但也有研究表明，该成分具有一定生殖毒性［8］、基因毒性［9］，而且存在剂量相关性［10］。虽然检索目前国内外医学文献均未发现含槟榔制剂致癌病例的报告，但不能排除槟榔入药有致突变、致癌的毒性［11］。遗传毒性评价是药物非临床安全性评价的重要内容，在预测化合物的潜在致癌性和可遗传突变方面具有重要应用价值。本实验根据药物遗传毒性研究技术指导原则规定［12］，采用经典的中国仓鼠肺细胞体外染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，对小儿消食片遗传毒性进行评价，以期为该制剂在临床合理用药及安全风险方面的研究提供实验依据。

1材料

1.1试药小儿消食片(批号1601016)，0.3g/片，由山东宏济堂制药集团股份有限公司提供。所用试剂均为分析纯。

1.2细胞、动物及菌株中国仓鼠肺细胞购自中国科学院上海生命科学研究院，经检测无支原体感染。昆明种小鼠，SPF级，体质量25～30g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001，实验动物使用许可证号SYXK(鲁)2014-0008。组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535购自美国Moltox公司，经生物学鉴定符合试验要求。

1.3仪器E100生物显微镜(日本尼康公司);LMQ．C立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司);YLN-50A菌落计数器(北京誉朗诺科技有限公司);HFsafe-1500TE生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)。

2方法［12-16］

2.1中国仓鼠肺细胞体外染色体畸变试验通过细胞毒性试验结果、细胞半数生长抑制浓度(6、24、48h内IC50分别为4.545、3.695、2.272mg/mL)设定染色体畸变试验剂量，同时设阳性对照组(注射用丝裂霉素、注射用环磷酰胺)和阴性对照组(0.9%氯化钠注射液)。取生长良好的中国仓鼠肺细胞，调整密度为1×105/mL，接种于25cm2细胞培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱内过夜培养24h。吸取培养液，加小儿消食片溶液，直接法分为6、24、48h作用组(代谢活化法为6h作用组)，其中6h作用组终质量浓度分别为5.0、2.5、1.25mg/mL，24h作用组分别为4.0、2.0、1.0mg/mL，48h作用组分别为2.5、1.25、0.625mg/mL。阳性对照组6h作用组采用0.15μg/mL注射用丝裂霉素［哺乳动物肝微粒体酶制剂(无S9)］和10μg/mL注射用环磷酰胺(有S9)，24、48h作用组采用0.05μg/mL注射用丝裂霉素;阴性对照组均采用0.9%氯化钠注射液。各组于终止培养收获前3～4h加入终质量浓度为0.4μg/mL的秋水仙素溶液，使染色体停滞于分裂中期，收集细胞，制片、染色后显微镜检验，选择分散较好的200个中期分裂相细胞，记录染色体形态变化，计算各组染色体结构畸变细胞的比例。

2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验根据药物遗传毒性研究技术指导原则，若供试品LD50大于5000mg/(kg·d)时，可取5000mg/(kg·d)作为最高剂量。取体质量25～29g的雄性小鼠72只，随机分为小儿消食片低、中、高剂量和最大溶解度组(1250、2500、5000mg/kg)，阴性对照组(纯化水)，阳性对照组(50mg/kg注射用环磷酰胺溶液)，每组12只，给药后于26～28、46～48h采样，结果以各剂量组的嗜多染细胞微核率(MNPCE)表示。观察200个嗜多染红细胞(PCE)，同时记录观察正染红细胞(NCE)数，计算PCE/(NCE+PCE)，并规定给药组PCE/(NCE+PCE)不应低于对照组的20%。

2.3鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验通过平皿掺入法，选择组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，分别采用直接法、代谢活化法。预试验结果表明，不加S9代谢活化系统时，小儿消食片各剂量组对TA98、TA100无显著抑菌作用，回变菌落数与阴性对照组相比无显著性差异(P＞0.05)，故正式试验中最高剂量设为5000μg/皿。每一菌株设5个剂量组，每组3个平皿，质量浓度分别为5000、2500、1250、625、312.5μg/皿，同时设阴性对照组(灭菌注射用水)和阳性对照组(不加S9混合液时，TA97a、TA98用2，4，7-三硝基-9-芴酮，剂量为0.2μg/皿，或用4-硝基喹啉-N-氧化物，剂量为0.5μg/皿;TA100、TA1535用叠氮钠，剂量为1.5μg/皿;TA102用注射用丝裂霉素，剂量为0.5μg/皿。加S9混合液时，TA97a、TA98、TA100用2-氨基芴，剂量为50μg/皿;TA102用1，8-二羟基蒽醌，剂量为50μg/皿;TA1535用注射用环磷酰胺，剂量为200μg/皿)。平皿置于37℃生化培养箱内培养，48h后观察计数。

2.4统计学分析通过DAS1.0软件进行统计学处理，数据以(x±s)表示。P＜0.05表示具有显著性差异，P＜0.01表示具有极显著性差异。

3结果

3.1中国仓鼠肺细胞体外染色体畸变试验表1显示，在1.25～5.0mg/mL下作用6h(±S9)，1.0～4.0mg/mL下作用24h，0.625～2.5mg/mL下作用48h时，染色体畸变数均＜5%，而且未呈现剂量反应关系，结果判定为阴性。

3.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验表2显示，小儿消食片各剂量组给药后于26、46h采样时，PCE/(PCE+NCE)与阴性对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)，表明对骨髓细胞的造血功能没有产生抑制作用，同时微核率亦然(P＞0.05)，表明对小鼠骨髓细胞无致微核作用，结果判定为阴性。

3.3鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验表3显示，在有或无S9活化系统的条件下，阴性对照组中各试验菌株的回复突变菌落数均在正常范围内，而阳性对照组显著更高(P＜0.01);小儿消食片在312.5～5000μg/皿剂量范围内无明显抑菌作用，回变菌落数与阴性对照组比较无显著变化(P＞0.05)，未呈现浓度依赖性增加，表明无诱导鼠伤寒沙门氏菌基因突变作用，结果判定为阴性。

4讨论

遗传毒性研究是药物非临床安全性评价的重要环节，与致癌性研究、生殖毒性研究均有着密切联系［12，17］。2006年，人用药物注册技术要求国际协调会议(ICH)在修订了新药遗传毒性注册评价的标准试验组合［18］。染色体畸变是外源化学物作用于机体或培养细胞后所引起的最常见遗传物质损伤之一［19］，该试验目前广泛应用于考察致突变现象，反映的遗传学终点是染色体分离、完整性改变［20］，其结果对评价供试品的遗传毒性具有重要价值［21］微核试验广泛用于评价新药、食品添加剂等对体内细胞或体外培养细胞的遗传学损伤［22］，是目前最常用的新药遗传毒性试验方法［19，23］，微核率增高可反映染色体损伤的遗传效应。污染物致突变性检测快速敏感，已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法［24］，可从基因水平反映遗传物质受损情况。本实验采用遗传毒性评价标准试验组合方法，分别从动物水平、染色体水平、基因水平综合评价小儿消食片遗传毒性，发现该制剂在本试验条件下无潜在遗传毒性，安全性良好。今后，将对小儿消食片中槟榔有效成分槟榔碱的毒性进行深入研究，并制订其含有量限度，为该制剂临床应用提供更全面的科学依据。

作者：李海燕1，谭乐俊1，孟兆青1，马玉奎2*，刘爱明2，高梅2单位：1．山东宏济堂制药集团股份有限公司，2．山东省药学科学院新药评价中心