还阳参化学成分探究范文

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《中国中药杂志》2015年第二十期

还阳参为菊科植物还阳参Crepiscrocea(Lam.)Babc.的干燥全草，味苦，性微寒，具有益气、止咳平喘、清热降火之功效，主要用于治疗慢性支气管炎、肺结核等疾病［1］。课题组前期对还阳参这一地方药材进行资源调查、化学及药理活性等多方面的研究，明确了还阳参含有酚酸，甾体，多糖等多种化学成分，分离并鉴定了数种化合物［2］。在前期研究中发现还阳参乙酸乙酯部位具有止咳平喘活性，本实验主要针对该部位化学成分进行研究。通过采用硅胶、MCI和SephadexLH-20柱色谱及制备液相等方法从乙酸乙酯部位中分离并鉴定了12个化合物，分别为还阳参酯素Ⅰ(1)，8β-(2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酮酰氧基)糖美菊素(2)，tectoroside(3)，木犀草素-7-O-葡萄糖苷(4)，大波斯菊苷(5)，七叶内酯(6)，原儿茶醛(7)，反式-4-羟基肉桂酸(8)，咖啡酸(9)，2-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸甲酯(10)，2-羟基-3(4-羟基苯基)丙酸乙酯(11)和顺式-3，4-二羟基-β-紫罗兰酮(12)。其中化合物1为新化合物，除化合物4，9外，其余化合物均为首次从该植物中分离得到。

1材料

BrukerDRX600MHz，BrukerDRX500MHz型核磁共振谱仪;APIQSTAR飞行时间质谱仪和VG-Auto-Spec-3000质谱仪BrukerApexIVFTMS;分析型HPLC为Agilent1100型(ZORBAXExtend-C18柱，4.6mm×150mm，5μm);制备型HPLC为Agilent1100(ZORBAXSB-C18柱，21.2mm×150mm和9.4mm×150mm，5μm);MPLC为瑞士步琪实验室技术服务有限公司BüchiSepacoreSystem;UV2450紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);傅里叶变换红外光谱仪(美国ThermoFisher公司)。乙腈(色谱纯)，TFA(分析纯)均为国药集团化学试剂有限公司产品。正相柱色谱硅胶(200～300目)由青岛海洋化工厂生产;反相柱色谱硅胶(ChromatorexC-18，40～75μm)由日本富士Silysia化工有限公司生产;SephadexLH-20由瑞典AmershamBiosciences公司生产;D101大孔树脂(批号120106)为天津市海光化工有限公司提供。还阳参C．crocea(Lam.)Babc.于2013年6月采自山西省雁北地区山阴县一带，放置阴凉处自然晾干，凭证标本(2013001)，由山西省食品药品检验所高天爱主任药师鉴定，存放于山西省中医药研究院。

2提取与分离

还阳参药材约4kg，粉碎，用70%乙醇回流提取3次，每次1h，滤液合并浓缩，浸膏，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取，萃取液减压浓缩，得石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层及水层4个部位。取乙酸乙酯萃取物200g，加水超声溶解后，滤过，滤液通过D101大孔吸附树脂进行柱色谱，依次用水，10%乙醇，50%乙醇，95%乙醇溶液洗脱，收集各部分洗脱液，依次命名为EA1～4，分别减压回收溶剂，冷冻干燥，取EA3部位(39g)经硅胶柱分离(氯仿-甲醇100∶1～5∶1洗脱)，分为6个部分Fr.1～6。Fr.2经硅胶柱(氯仿-甲醇50∶1洗脱)分为3个部分Fr.2.1～2.3，Fr.2.1进一步经Sepha-dexLH-20柱(氯仿-甲醇1∶1洗脱)分离得到化合物11(1.065g)。Fr.2.2经SephadexLH-20柱(氯仿-甲醇1∶1洗脱)分离得到化合物12(675mg)。Fr.2.3经硅胶柱分离(氯仿-甲醇100∶1～25∶1)及重结晶分别得到化合物1(39mg)和6(376mg);母液进一步经中压制备液相(MPLC，10%～30%甲醇洗脱)分离得到2个部分Fr.A，B。Fr.A经硅胶柱分离(氯仿-甲醇70∶1)及重结晶得到化合物7(115mg);Fr.B经SephadexLH-20柱分离(氯仿-甲醇1∶1洗脱)及重结晶得到化合物8(21mg)。Fr.3重结晶得到化合物9(1.176g)。Fr.4经MPLC(10%甲醇～甲醇洗脱)分离得到6个部分Fr.4.1～4.6，Fr.4.1经SephadexLH-20柱(甲醇洗脱)分离得到化合物10(52mg);Fr.4.2经SephadexLH-20柱(甲醇洗脱)、硅胶柱色谱(氯仿-甲醇20∶1～5∶1)分离得到2个部分Fr.C，D。Fr.C经SephadexLH-20柱(氯仿-甲醇1∶1洗脱)分离得到化合物2(100mg)。Fr.5进一步经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇20∶1～5∶1洗脱)、SephadexLH-20柱(氯仿-甲醇1∶1洗脱)分离得到化合物3(54mg)。Fr.6经MPLC(10%～30%甲醇洗脱)分离得到化合物4(34mg)和5(2mg)。以上化合物经HPLC检测纯度均＞95%。

3结构鉴定

化合物1无色结晶(CHCl3)，HR-ESI-MSm/z449.1564［M+Na］+(计算值为449.1576)，分子式为C24H26O7，不饱和度为12。UV(MeOH)λmax:221，278nm。IR(KBr)νmax:3467，3277，2951，1736，1723，1664，1254，1167，965，840cm－1。13C-NMR(DMSO-d6，150MHz)及1H-NMR(DMSO-d6，600MHz)谱显示化合物有1个甲基，4个亚甲基，6个次甲基，4个季碳，1个内酯环，2个双键。其中δC193.4(C-3)，δC169.0(C-12)为2个羰基信号，δC144.2(C-10)和δC135.3(C-11)为2个双键季碳信号，δC121.8(C-13)，δC115.1(C-14)为2个双键亚甲基碳信号。以上2个双键季碳信号，2个双键亚甲基碳信号和2个羰基信号为典型的愈创木烷型倍半萜的10(14)，11(13)，3和12位的环外双键特征［3］。1H-NMR谱中的δ4.41表明存在愈创木烷内酯环［4］，结合其他碳氢信号，进一步证实化合物1为愈创木烷内酯类化合物［4］。化合物波谱数据与文献［5］中报道的化合物8-epigrosheimin数据及其相似，所不同的是化合物在C-8位连接的是酯基而不是羟基。HMBC谱中，H-8(δH5.53)与C-1'(δC172.9)有远程相关，证实C-8位连有酯键;羟基-OH质子信号(δH5.46)与C-1'(δC172.9)，C-2'(δC71.5)和C-3'(δC39.2)有远程相关，证实羟基连在C-2'位。1H-NMR谱中，δH9.17(1H，s)提示为酚羟基-OH质子信号，δH6.96(2H，d，J=8.4Hz)，δH6.61(2H，d，J=8.4Hz)提示为4个苯环氢质子信号，HMBC谱中，H-3'(δH2.63，2.77，dd)与C-1'(δC172.9)，C-2'(δC71.5)，C-1″(δC127.6)，C-2″/C-6″(δC130.2)有远程相关，证实对羟苯基连在C-3'位。与相同位置构型一样的同类型化合物8β-(2-羟基)-2-甲基-3-氧代丁酮酰氧基-糖美菊素进行数据比对，确定化合物1位，5位，7位，8位质子和15位甲基均在一侧，为α构型［5］。结合NOE差谱:照射H-6，发现H-4有增益，表明H-6与H-4在同一侧均为β构型。至此，确定化合物1的相对构型，各基团的连接顺序见图1。根据SciFinder检索，该化合物未见报道，为新化合物，命名为还阳参酯素Ⅰ。其核磁数据归属见表1。

作者：李媛媛 彭照琪 贺石麟 倪艳 郝旭亮 单位：山西省中医药研究院