双醋瑞因有关物质的测定范文

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《中国医药工业杂志》2016年第四期

摘要：

建立了高效液相色谱法测定双醋瑞因的9个有关物质。采用PhenomenexProdigy100AODS3色谱柱，以乙腈∶25mmol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调至pH2.2)(42∶58)为流动相，检测波长254nm。双醋瑞因及其有关物质(除七乙酰芦荟苷)在0.2～3.0g/ml范围内线性关系良好，七乙酰芦荟苷在0.6～3.0g/ml浓度范围内线性关系良好。有关物质的平均回收率96.8％～99.9％，RSD为1.7％～3.5％。

关键词：

双醋瑞因；有关物质；高效液相色谱；测定

双醋瑞因(diacerein，1)，化学名为4,5-二乙酰氧基-9,10-二氢-9,10-二氧代-2-蒽羧酸，是白介素(IL)-1抑制剂，主要用于治疗骨关节炎[1]。本品以芦荟大黄素(3)为原料，经过酰化制得三乙酰芦荟大黄素(6)，再经氧化制得。依据合成路线[2,3]，1中可能存在原料3和中间体6，还有1的降解产物或副产物5-乙酰大黄酸(2)、4-乙酰大黄酸(4)和大黄酸(5)，而起始原料3中可能引入七乙酰芦荟苷(7)、八乙酰芦荟苷(8)、大黄素(9)和三乙酰大黄素(10)等有关物质。现有报道主要采用HPLC法分析1[4—6]，所考察的有关物质主要有2、4和5[7,8]。本研究建立了HPLC法同时测定本品中的1及其9个有关物质。本法简单、准确可靠，可有效控制产品质量。

1仪器与试药

LC-10ATvp型高效液相色谱仪，包括LC-10ATvp型泵、SIL-10AF型自动进样器、SPD-10Avp型紫外检测器和LCsolutionLite工作站(日本Shimadzu公司)；2695型高效液相色谱仪和2996型二极管阵列检测器(DAD)(美国Waters公司)。1原料药(江西欧氏药业有限责任公司，批号120701、120702和120703)；1(含量99.6％，批号140301)、6(含量99.2％，批号120303)和10(纯度97.5％，批号100502)对照品均为本公司自制；3(含量98.0％，批号110795-201007)、5(含量100％，批号0757-200206)和9(含量100％，批号0756-200110)对照品均购自中国食品药品检定研究院；2(含量98.0％，批号110312)和4(含量97.8％，批号DAR-0707-01)对照品均购自深圳鸿科生物科技有限公司；7(含量96.2％，批号130514)和8(含量98.2％，批号130510)对照品均购自广州优瓦仪器有限公司。乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾、磷酸和冰乙酸均为分析纯，水为纯化水。

2方法与结果

2.1溶液配制供试品溶液：精密称取1原料药10mg，置50ml量瓶中，加N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)5ml，超声溶解，再加流动相定容，摇匀，得浓度为200g/ml的供试品溶液。自身对照液：精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相定容，摇匀，得浓度为2g/ml的自身对照液。系统适用性溶液：精密称取1和有关物质2～10对照品适量，用DMAC溶解，加流动相稀释制成含1约50g/ml，含有关物质2～10约2g/ml的系统适用性溶液。

2.2色谱条件与系统适用性试验色谱柱PhenomenexProdigy100AODS3柱(4.6mm×250mm，5m)；流动相乙腈∶0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调至pH2.2)(42∶58)；检测波长254nm；流速1ml/min；柱温30℃；进样量10l。取供试品溶液、自身对照液和系统适用性溶液，分别进样，记录色谱图(见图2)。结果显示1～10间的分离度均不低于1.5，理论板数以1峰计大于6000。

2.3专属性试验取1原料药10mg，用DMAC溶解，分别进行酸、碱、光照、氧化和高温降解，将pH值调至中性后，用流动相稀释制成200g/ml的溶液，分别进样测定。结果表明1在上述条件下均发生不同程度的降解，各降解产物与1分离完全。其中酸、碱和氧化条件下产生的降解物分别与化合物2、4、5的保留时间相同，可能产生的途径为1中的酯基水解产生2、4，并进一步水解产生5。光照条件下除有少量降解为2、4外，较大的降解峰可能为9，此外还有与2～10结构不同的未知降解峰；高温与光照条件下产生的降解物种类相似，以2、4和未知降解产物为主。二者的降解途径除酯基水解外，可能与蒽醌结构的变化有关。比较上述降解条件下的色谱图可见，1在光照和碱性条件下稳定性较差，试验过程中应避光且避免接触碱溶液。用DAD检测器验证上述降解条件下的供试品溶液峰纯度，结果显示峰纯度良好。

2.4线性试验分别精密称取1～10对照品适量，分别用DMAC溶解，以乙腈稀释制成100g/ml的1～10对照品贮备液。精密量取1、2～6和8～10对照品贮备液适量，用乙腈溶解并稀释，制成含1、2～6和8～10分别为0.2、0.6、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0g/ml的混合对照品溶液；另取7对照品贮备液，用乙腈稀释制成浓度为0.6、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0g/ml的溶液。按“2.2”项下条件分别进样，记录色谱图，以浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归；再以主成分1与各有关物质2～10的线性回归方程斜率的比值计算相对校正因子。线性回归方程、相对校正因子(RCF)、检测限(LOD)和定量限(LOQ)结果见表1。结果表明，1、2～6和8～10在0.2～3.0g/ml、7在0.6～3.0g/ml范围内，峰面积与浓度的线性关系均良好。除7、8外，其他有关物质的RCF均介于0.9～1.1，故可用主成分自身对照法计算含量；如检出有关物质7、8，则采用加校正因子的主成分自身对照法计算含量。1及其有关物质(除7外)的LOD为0.006～0.05g/ml(相当于供试品溶液浓度的0.003％～0.02％)，LOQ为0.02～0.15g/ml(相当于供试品溶液浓度的0.01％～0.075％)。有关物质7的LOD相当于供试品溶液浓度的0.085％。

2.5精密度及稳定性试验按“2.1”项下方法制备供试品溶液，共6份，分别进样测定，计算得有关物质2、4峰面积的RSD为1.8％、1.5％，其他有关物质均未检出。按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12和24h进样测定，计算得1、2、4峰面积的RSD分别为0.2％、2.8％和1.4％，其他有关物质均未检出。结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

2.6有关物质加样回收率试验精密称取1原料药10mg，共11份，各置50ml量瓶中，分别加入DMAC5ml，超声溶解。取其中2份，加流动相定容，摇匀，作为空白溶液；将另外9份分成3组，各3份，按高、中、低浓度(相当于主成分浓度的0.3％、0.2％和0.1％)分别加入2～10(7、8除外)混合对照品溶液适量，用流动相定容，摇匀，作为质控溶液。取空白溶液、质控溶液和2～10(7、8除外)混合对照品溶液，分别进样，记录峰面积，按外标法计算其中有关物质的含量，并计算回收率。结果表明，所考察的有关物质的平均回收率(n=9)为96.8％～99.9％，RSD为1.7％～3.5％。

2.7样品测定按“2.1”项下方法制备供试品溶液和自身对照液，分别进样测定，记录色谱图。量取供试品溶液所得色谱图中除主峰外的各有关物质峰的峰面积，2～10(7、8除外)用主成分自身对照法计算有关物质含量，如检出有关物质7、8，则采用加校正因子的主成分自身对照法计算含量。3批样品测定结果见表2。结果表明，3批1原料药中只检出2、4，其他有关物质均未检出，总杂质均小于0.3％。

3讨论

取2～10对照品溶液，用乙腈稀释至适宜浓度，在200～400nm波长范围内扫描，结果表明，上述有关物质与1的紫外吸收特征相似，均在254nm处有最大吸收，且吸收值相当。故选择254nm作为检测波长。参考文献[9,10]，本研究分别比较了乙腈∶0.1mol/L磷酸(40∶60，流动相Ⅰ)、乙腈∶水(用乙酸调至pH2.7)(47∶53，流动相Ⅱ)、乙腈∶0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调至pH2.2)(42∶58，流动相Ⅲ)等不同体系对样品的分离效果。流动相Ⅰ的pH值约为1.5，柱压较高，会减少色谱柱寿命；流动相Ⅱ的分离效果良好，但乙酸易挥发不易控制pH值，且用量较大；综合考虑，最终选用流动相Ⅲ。曾用磷酸将流动相调至pH2.0、2.2、2.5、3.0、3.5和4.0，结果显示pH值越大，1保留时间越小。推测是由于1结构中存在羧基，显弱酸性，pH值的改变影响其电离情况。在pH2.2时，1保留时间适中，峰形对称，各有关物质与1分离良好。pH值增大或减小均会改变1与其他有关物质的相对保留时间，进而影响分离效果。有关物质7、8由于检测灵敏度低，在回收率试验浓度范围内无法获得准确回收率，故未列出测定结果。

作者：苑洪忠 于文国 赵孝先 姚换方 赵凯 单位：河北凯盛医药科技有限公司 河北医科大学第四医院 江西欧氏药业有限责任公司