阪崎肠杆菌凝集技术探究范文

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《中国预防兽医学报》2014年第八期

1实验步骤

1.1CSN的制备采用油包水的反相微乳液法合成CSN[11]。通过正硅酸乙酯(TEOS)的水解和缩聚反应，并以TritonX-100、正己醇、环己烷分别为表面活性剂、助表面活性剂和有机溶剂，氨水作为催化剂，制备二氧化硅纳米微球；为合成彩色微球，在反应过程中分别加入活性大红3G、活性橙黄X-GN、活性蓝绿(活性翠兰KN-G与活性嫩黄4GLN按1∶1调配)等有机活性染料各150μL；为消除二氧化硅纳米微球之间的团聚，加入20μL硅烷偶联剂KH-550在微球表面引入氨基，增大表面电位以促进微球之间的分散度，形成单分散彩色微球。连续反应48h后用丙酮破乳、离心并收集颗粒，将得到的CSN分散在5mL超纯水中备用。

1.2CSN的粒径和形貌表征采用场发射扫描电镜SU-70和Nano2S激光粒度电位仪对各参数下制备的二氧化硅纳米微球的粒径和形貌进行表征。

1.3CSN的活化将合成的CSN用超纯水清洗三次，分散到20mL水中超声10min使微球均匀分散，分别加入1.4mL冰乙酸和0.2mL的APTE搅拌均匀后持续震荡反应1h。将反应后的微球用水清洗3次，分散到10mL琥珀酸酐和DMF的混合溶液中在通氮气条件下持续振荡反应5h，离心、清洗后即可得到富含羧基的活性微球，将其4℃条件下保存备用。

1.4ICSN的制备及反应原理配制pH6.8浓度为0.1mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液(MES)，在5mLMES缓冲液中分别加入500mg的N-羟基丁二酰亚胺和500mg的DEHE，加入活化后的CSN室温下反应1h。离心后得到的微球分散到pH7.3浓度0.1mol/LPBS中。取10mL分散的活化微球与10μLE.sakazakii凝集抗体，室温下孵育4h，用PBS清洗、离心后得到ICSN，分散到5mLPBS中，4℃条件下保存备用。

1.5制备抗原制取一定浓度的E.sakazakii菌液，将其用0.4%甲醛溶液灭活，并进行灭活检测，确定灭活后稀释成所需浓度。

1.6不同ICSN凝集试验将不同颜色的ICSN各10μL分别与等量的待测抗原滴加在洁净的凹圆载玻片上，混匀至抗原抗体充分反应，在1min～3min内观察凝集现象，同时设阴性对照，除特别说明以外的其它凝集反应均在室温(22℃±2℃)下进行。

1.7ICSN的特异性将标记E.sakazakii抗体的ICSN分别与浓度相同的E.sakazakii、S.pullorum&gallinarum、E.coli、S.flexneri进行凝集试验，用生理盐水做阴性对照，观察凝集现象。

1.8ICSN的敏感性用ICSN分别与浓度为6×101cfu/mL～6×109cfu/mL的E.sakazakii进行凝集试验，并以生理盐水为阴性对照，观察凝集效果，评价其敏感性。

1.9凝集反应最适温度的选择取10μL蓝色ICSN与10μLE.sakazakii，分别在温度为0℃、22℃、37℃、45℃和60℃条件下进行凝集反应，观察凝集效果，以确定出现明显凝集现象的最适温度。

1.10稳定性将制备的ICSN在4℃条件下放置30d，而后取出室温放置，使其温度达到室温，观察与E.sakazakii的凝集效果，测其储存稳定性。

2结果

2.1CSN的制备研制的单分散彩色二氧化硅纳米活性微球如图2所示。图2A为活性大红3G、活性橙黄X-GN、活性嫩黄4GLN、活性绿(活性翠兰KN-G与活性嫩黄4GLN按1∶1调配)、活性翠兰KN-G、活性芷青GD和活性紫KN-4R染色后的7种颜色的CSN；图2B为合成的CSN的扫描电镜图，由图可知，这些彩色微球的形状规则、大小均一(约70μm)、表面光滑并且具有较好的分散性。

2.2ICSN凝集试验分别用蓝色、黄色和红色3种颜色的ICSN与E.sakazakii菌悬液进行凝集反应，反应结果如图3所示。以3种不同颜色的ICSN分别与E.sakazakii的玻片凝集反应，在1min～3min均出现明显的团状或絮状凝集现象，液滴变得澄清，凝集现象醒目、直观及易于判别(图3A、B、C)。表明ICSN具有很好的免疫凝集特性，并且3种不同颜色的ICSN均具有同样良好的凝集效果，即不同种颜色有机活性染料对ICSN与抗原的凝集反应过程均无可见影响，染料只起显色、醒目的效果。而在ICSN中加入生理盐水可以观察到微球均匀分散在液滴中，无任何凝集块出现，表明包被抗体的ICSN既不与生理盐水发生反应，也无自凝现象。

2.3ICSN的特异性为考察基于ICSN的新型凝集试验的特异性，本研究选用了3种常见致病菌分别与E.sakazakii修饰的ICSN进行凝集试验，并以生理盐水为阴性对照，结果显示，标记E.sakazakii抗体的蓝色ICSN仅与E.sakazakii发生凝集反应，与S.pullorum&S.gallinarum、E.coli、S.flexneri均未发生凝集，用生理盐水做阴性对照，表明ICSN具有良好的特异性。

2.4ICSN敏感性测定采用蓝色ICSN与不同浓度E.sakazakii菌液的凝集结果显示，当菌液浓度为6×109cfu/mL和6×108cfu/mL时，出现粗大凝集块，液滴澄清，凝集现象清晰、醒目，凝集结果判定为++++；当菌液浓度为6×107cfu/mL和6×106cfu/mL时，出现粗大凝集块，液滴有少量浑浊，凝集现象清晰醒目，判定为+++；当菌液浓度为6×105cfu/mL、6×104cfu/mL和6×103cfu/mL时，出现较明显的凝集块，液滴较浑浊，判定为++；当菌液浓度为6×102cfu/mL时，显示肉眼可见的轻微凝集现象出现，液滴浑浊，凝集结果判定为±；浓度为6×101cfu/mL的菌液和生理盐水中未观察到凝集现象(图5)。结果表明，ICSN具有较好的灵敏度，对E.sakazakii的检测范围为6×103cfu/mL～6×109cfu/mL。

2.5凝集反应最适温度的选择凝集试验是基于抗原与抗体之间的特异性反应，其中抗体的活性是凝集试验的效果好坏的关键，在各种因素中反应温度对抗体活性的影响较为明显(图6)。图6结果显示，22℃～37℃的条件下，ICSN与E.sakazakii最先发生明显的凝集反应，出现凝集现象较快，仅为20s～30s，凝集效果清晰、醒目，并且该温度接近室温，便于操作，因此选择22℃～37℃为最佳凝集反应温度。当温度为45℃和60℃时，凝集现象依次减弱，这与常规凝集试验相同。

2.6稳定性试验4℃放置30d后的3种颜色的ICSN的凝集效果与储存前无显著差异，表明ICSN的稳定性好。

3讨论

本研究应用二氧化硅活性微球与有机活性染料共价结合制成CSN作为新型凝集试验的载体。二氧化硅活性微球具有稳定、不溶胀、耐储存、生物相容性好和经济易得等优点，近年来在分析检测领域备受关注[12-14]。由于二氧化硅微球无色，作为间接凝集试验的载体其凝集结果不够清晰、直观，影响检测方法的敏感性和准确性，若使其带有鲜艳的颜色，则可以克服上述不足而成为间接凝集试验理想的载体。因此，如何给微球染色则成为制备理想间接凝集试验载体的关键。有机活性染料色彩丰富，生物相容性好，在光照、高温、强酸、强碱等恶劣条件下稳定、不退色，并且自身具有活性基团可以和氨基、羟基以及羧基发生化学作用。本研究将二氧化硅活性微球与有机活性染料通过共价结合制成CSN，既克服了白色二氧化硅微球的不足，又能充分利用该微球和有机活性染料的双重优势，研制的彩色微球具有分散性好、不溶胀、色彩鲜艳、性能稳定、生物相容性好等优点，并能够作为理想的凝集试验载体。采用E.sakazakii抗体修饰CSN可制成ICSN，并基于该ICSN构建一种新型凝集技术。该新型凝集技术灵敏度高，反应现象清晰、醒目，易于判别，对E.sakazakii的检测范围为6×103cfu/mL～6×109cfu/mL；检测速度快，检测时间在22℃～37℃下仅为20s～30s，明显快于常规凝集试验的数分钟；特异性和准确性较好，ICSN仅与E.sakazakii发生凝集反应，与其它致病菌试验菌种均无可见凝集现象；稳定(4℃放置30d后未见发生溶胀、褪色、自凝等变化，凝集效果与储存前无显著差异)、简便并且经济。利用ICSN构建的新型凝集技术，不仅可用于E.sakazakii的快速检测，也可以扩展研究用于其它致病微生物的快速检测。

作者：杨磊赵广英窦文超单位：浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室