菌毛结构及其致病性研究范文

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《中国预防兽医学报》2014年第八期

1菌毛表达

Ⅰ型菌毛表达严格受到外界环境的影响，温度、pH、渗透压、培养基等因素在一定程度上均影响菌毛的表达。恽时锋等将禽源大肠杆菌分离株MG40e(O88)、MG38e(O88)、Q33c(O115)、MG30e(O88)分别于37℃、28℃、18℃培养72h，结果显示仅37℃培养时能表达大量细长而密集的菌毛，低于37℃只表达少量菌毛或无菌毛[11]。Schwan等发现，酸性培养条件下fim启动子(fimA，fimB，fimE)的表达都轻微下降；中性培养条件下增加渗透压(400mMNaCl)则fimA和fimB的转录下降约50%，当渗透压进一步升高(800mMNaCl，fimA和fimB转录下降近3倍，而fimE的转录却轻微上升；酸性条件下增加渗透压(800mMNaCl)使fimA和fimB的转录水平下降5倍，而fimE的转录量却是原来的2倍。由此证明高渗及低pH会抑制Ⅰ型菌毛的表达，并且其下调是通过介导相变开关的状态实现的[12]。此外，培养基的选择也影响到Ⅰ型菌毛表达。肉汤培养基比固体培养基更有利于菌毛表达，液体肉汤静置培养会使得细菌最大程度地表达Ⅰ型菌毛。这是因为环境中疏水菌毛使得细菌在液气界面形成一个薄膜层，以便最大程度的获取大气氧。无菌毛表达的菌株经过几代静止培养连续传代后，部分菌株菌毛化。再将它们接种到固体平板上培养几代之后，又显示甘露糖敏感性血凝试验阴性(MSHA-)[13]。

2生物学相关特性

作为Ⅰ型菌毛结构性蛋白FimH，介导Ⅰ型菌毛凝集特定动物红细胞以及酵母细胞。红细胞膜上含有甘露糖低聚寡糖，酵母细胞壁中的主要成分是甘露聚糖，FimH能结合甘露糖发生凝集反应，而且该凝集性能被D-甘露糖所抑制，因此Ⅰ型菌毛又称为甘露糖敏感性(Mannosesen-sitive，MS)菌毛。不同种类动物的红细胞糖链差异性，因而不同菌株的凝集谱不同。在禽源沙门氏菌菌株中存在Ⅱ型菌毛，在遗传和免疫水平上与鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛密切相关，它拥有完整的FimH，但却无甘露糖敏感性、凝集活性以及体外黏附细胞的能力，可能是由于N末端区域的一小部分氨基酸的置换所导致的。FimH的晶体结构研究表明，糖结合区域位于N末端aa1～aa156，而与菌毛柄相关的区域则位于C末端aa160～aa277。然而，研究表明，Ⅰ型菌毛的结合特异性不仅是由FimH亚单位决定的，它也受由FimA构成的菌毛轴所调节[16]，或许是通过它强加于FimH上的构像限制实现的。鉴于Ⅰ型菌毛是由甘露糖特异性结合特性来定义的，但越来越多的研究数据表明，在不同的菌属中，存在Ⅰ型菌毛异质性，例如在大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌中就存在显著的差异，而即使是相同的菌种，也存在结合机制不同[18]，可能与FimH的共价结构有关。Sokurenko等研究表明有两种类型的甘露糖敏感性Ⅰ型菌毛，一种为我们所熟知的甘露糖凝集素活性，必须结合包含有甘露糖的糖蛋白；而另外一种不仅具有MS凝集素活性，还可以与非糖基化的蛋白片段结合，并且其结合能够被甘露糖所抑制[19]。Ⅰ型菌毛这一特性赋予了细菌黏附至多种细胞的能力，包括红细胞、上皮细胞、粒细胞、巨噬细胞及肥大细胞等。Ⅰ型菌毛这种功能上的差别可能与它的组成蛋白FimA、FimF、FimG、FimH或者它们聚合成菌毛丝的方式有关，具体机制仍有待研究。

3致病性

Ⅰ型菌毛是细菌重要的毒力因子，可通过促进对宿主粘膜表面的黏附、侵袭以及引发机体的免疫应答等途径增强细菌的致病力。典型的例子为UPEC，它在泌尿道上皮细胞上的受体属于尿路上皮特异蛋白(Uroplakin)，一种甘露糖含量很高的糖蛋白，分布在伞状泌尿上皮细胞表面。一些动物模型试验均表明Ⅰ型菌毛增加了UPEC在泌尿道中存活几率。

3.1黏附能力一直以来，Ⅰ型菌毛被认为是普遍存在于肠道致病菌表面的黏附因子，通过其顶端的FimH蛋白与甘露糖受体以化学键特异性牢固结合，介导致病菌黏附至宿主上皮细胞，以避免因震荡、冲刷而脱离粘膜上皮，为进一步侵入机体创造条件。由于一个菌株中一般具有许多黏附因子，而这些基因的相互作用、对细菌毒力因子的影响等众多因素形成的复杂调节网络，从而使得单独研究一种特定的黏附素作用变得异常困难。Krekeler等发现利用在不含有其它已知黏附素基因的UPEC菌株P4(分离自有子宫积脓临床症状犬的子宫)上插入突变fimH基因，导致对于犬子宫内膜的黏附显著下降，只有野生株的0.3%。这一研究结果首次证明Ⅰ型菌毛在促进大肠杆菌对子宫内膜黏附作用中的关键作用。Trautner等发现将fim+质粒转化入非致病菌E.coli83972中，可以显著提高其黏附能力并且增强对后续致病细菌定植的干扰能力。本实验室构建了几株禽致病性大肠杆菌分离株的Ⅰ型菌毛fimH基因缺失株，通过人肺上皮细胞(A549)和嗜中性粒细胞(分离自3日龄健康鸡血)的黏附试验，表明禽致病性大肠杆菌的Ⅰ型菌毛可以促进细胞的黏附与定植。一些研究者发现由于Ⅰ型菌毛在致病性(分离自有泌尿道疾病的犬)和非致病性(分离自犬肠道)大肠杆菌中有着同样的高频度表型，因而表明Ⅰ型菌毛对于致病性几乎无贡献。而一些学者则强调大肠杆菌Ⅰ型菌毛的相变性可能会影响对泌尿道的致病力，因为Ⅰ型菌毛的表达可能会依赖细胞微环境，进而对细菌的毒力贡献不同。因此，今后Ⅰ型菌毛研究不仅仅局限于其基因的分布，而应拓展到mRNA和蛋白水平。在沙门氏菌和肺炎克雷伯氏菌中，Ⅰ型菌毛均介导了不同程度的黏附功能。

3.2侵袭能力除了黏附性能外，Ⅰ型菌毛在对细胞的侵袭过程中同样发挥重要的作用。Boudeau发现分离自患有克罗恩氏(Crown''''s)疾病患者体内的大肠杆菌菌株LF82具有黏附、侵袭一些列肠道上皮细胞的能力(包括细胞系407、Caco-2、HCT及HEp-2)，而它本身不含有已知的一些黏附侵袭因子，因而被归为一种新的潜在致病菌AIEC(Adherent-invasiveE.coli)。在菌株LF82的fim操纵子中插入突变后，大部分菌株均丧失侵袭能力，这进一步验证了它的侵袭能力是由Ⅰ型菌毛介导的。此外，在其它大肠杆菌以及沙门氏菌中，均有Ⅰ型菌毛影响细菌侵袭能力的研究报道。然而，不同的菌种甚至是同一菌种不同的变种和型，都可能具有不同程度的侵袭能力。例如，牙周病致病菌牙龈朴琳单胞菌中，根据fimA序列的不同分为6个基因型，除了具有Ⅱ型fimA的菌株黏附侵袭能力最强，其它所有基因型均有黏附能力，而它们对于人口腔上皮癌细胞(KBcells)的侵袭效率并不高，而且程度不同。有研究表明在气单胞菌中，利用fim操纵子的缺失株与野生株进行体外试验，缺失株黏附能力显著下降，而侵袭能力却无变化。由此表明，虽然Ⅰ型菌毛在某种程度上介导了细菌的侵袭能力，增加了致病性，但其内在机理还有待进一步研究。

3.3生物被膜形成能力许多研究表明在UPEC中，Ⅰ型菌毛有促进生物被膜形成的能力，对于细菌起始黏附至泌尿生殖道并引发感染的过程起到了关键的作用。Jen-nifer等发现，两个具有MSHA活性的鼠伤寒沙门氏菌分离株却呈现不同的生物被膜形成能力，它们的区别在于FimH的两个氨基酸位点存在突变，而将位于61位的甘氨酸置换成丙氨酸即可赋予菌株形成生物被膜的能力。然而，也有很多研究表明Ⅰ型菌毛对生物被膜的形成无调节作用甚至是负相关的。例如，大多数肺炎克雷伯氏菌均表达Ⅰ型和Ⅲ型菌毛两种黏附素，Ⅰ型菌毛是引发UTI的关键，但却发现Ⅰ型菌毛的表达会下调生物膜的形成，非毒力因子的Ⅲ型菌毛却有促进生物被膜形成的能力。在新洋葱伯克霍尔德菌中，Ⅰ型菌毛对于生物被膜的形成也是非必需的[30]。总而言之，Ⅰ型菌毛对于细菌生物被膜的调控涉及到很多调控因子，而对于这一领域的深入研究有助于诠释Ⅰ型菌毛的致病机制。

3.4免疫反应Ⅰ型菌毛在引发宿主免疫应答方面的关键作用应引起关注。早期研究表明Ⅰ型菌毛可以通过宿主细胞表面的甘露糖受体促进细菌与吞噬细胞和中性粒细胞之间的相互作用，从而引发对细菌的内吞作用。Fischer等利用fim+和fim-菌株、TLRWT和TLR-小鼠、MyD88WT和MyD88-小鼠，通过尿道感染实验表明，大肠杆菌的Ⅰ型菌毛通过TLR4和MyD88两种炎症反应信号通路蛋白来激发宿主的免疫应答[33]。因此，Ⅰ型菌毛也可以作为一种疫苗为宿主提供有效的保护力。虽然在动物模型中，Ⅰ型菌毛可以引发UTI，但有研究表明，同样的菌株(E.coli83972)却不能激发人类泌尿道促炎性反应应答，也几乎无粘膜黏附能力。这与P菌毛的结果完全相反，但还不能排除Ⅰ型菌毛可能通过其它机制影响细菌的毒力。

3.5与其它黏附因子间互作Ⅰ型菌毛作为细菌的一种表面黏附素，和其它表面黏附因子之间的互作也愈发受到关注。例如，Mobley实验室对UPEC菌株CFT073和E.coliK12MG1655的Ⅰ型菌毛与鞭毛之间的相互影响的研究结果表明，Ⅰ型菌毛的组成性表达使得鞭毛表达显著降低，从而抑制了运动性和趋化性，而Ⅰ型菌毛的缺失却并无增加运动性；反过来，鞭毛的过量表达或是过少也不影响Ⅰ型菌毛的表达量，即它们之间是单向调控的，并且还发现这种协调表达是多基因共同作用的结果。Bar-nich发现大肠杆菌菌株LF82的fliC缺失突变显著下调了Ⅰ型菌毛的表达，猜测可能是鞭毛调控元件flhDC直接或间接的作用。本实验室Duan发现将F18+E.coli的fliC缺失后，fimH的转录水平上升了近2倍。细菌表面黏附素之间的协同控制是一个复杂的网络系统，并有待进一步研究。

4总结与展望

Ⅰ型菌毛结构是在电子显微镜下观察到的第一个细胞外非鞭毛丝状附着物，由染色体编码，是病原菌的重要致病因子，具有很好的免疫原性。鉴于Ⅰ型菌毛的普遍表型，人们一直忽略了它的致病性，对于其作为毒力因子的重要性没有一个统一的共识。大多数研究者认为Ⅰ型菌毛是细菌的一个重要毒力因子，它们显著提高了病原菌对机体的感染率。但也有研究表明，在fim操纵子中插入突变后，接种成年兔的腹膜，与有Ⅰ型菌毛的野生株相比，无Ⅰ型菌毛的突变株能引发更高的死亡率和更快的死亡速度。因此，Ⅰ型菌毛是通过一系列机制改变了腹膜感染的结果。综合而言，Ⅰ型菌毛在很大程度上影响着细菌对宿主细胞的致病性，但其致病机理仍有待进一步研究。虽然越来越多有关Ⅰ型菌毛的功能与致病性被逐渐发现，但仍有许多未知领域，例如相变开关究竟受哪些因素调控，引发促炎性反应的机理，是否和肠道致病菌的毒力直接相关，能否作为一种安全有效的疫苗投入市场等等，对于Ⅰ型菌毛乃至其它黏附素的探索研究仍任重而道远。

作者：郭志燕周明旭朱国强单位：扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心