棘豆内生真菌种群多样性探讨范文

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《中国兽医学报》2014年第七期

1材料与方法

1．1植物样品样品采自为青海省祁连县。祁连县位于青海省海北藏族自治州境北部，东、北部与甘肃省接壤，县境内草场辽阔，总面积为117．6万hm2，占全县土地面积的80％，属大陆性高寒山区气候，年均气温1℃，年降水量为270～600mm。本次试验所用植物样品为2012年8月采集的甘肃棘豆茎和叶，采集后立即用变色硅胶脱水并避光保存备用。

1．2培养基本次试验所用的2种培养基均为本实验室自配，具体配方如下：马铃薯糖琼脂培养基（Potatodextroseagar，PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。豆芽糖琼脂培养基（Beansproutsdextroseagar，BDA）：黄豆芽100g，琼脂15g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

1．3主要仪器与试剂DNA聚合酶等分子生物学试剂，均购自TaKaRa公司；PCR基因扩增仪，购自美国Bio－Rad公司；琼脂糖购自美国SIGMA公司；胶回收试剂盒购自于北京天根生化科技有限公司；南京金斯瑞公司完成测序；恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；有机试剂均为国产分析纯；提取DNA所用CTAB溶液为本实验室自配。

1．4内生真菌分离与纯化表面消毒组织块分离法分别将甘肃棘豆的茎和叶用蒸馏水冲洗干净，经75％乙醇漂洗30s、无菌水冲洗3次、有效氯为2％次氯酸钠漂洗3～5min、无菌水冲洗3～5次后，再将叶剪成约5mm×5mm小块，茎剪成约3～5mm小段，然后分别置PDA和BDA平板上，在黑暗和光照条件下于室温下培养，定时观察。为检查表面消毒是否彻底，在对照平板上作无菌水和组织印迹检测，若平板无任何菌生长，证明表面消毒效果良好。待组织块切口处长出菌丝后，挑取顶端菌丝转接至新的培养基上，然后继续采用尖端挑取法纯化2～3次，将纯化后的菌株编号，随后将菌株接种至试管斜面，4℃冰箱保存备用。另将纯化编号的菌株刮取菌丝用于提取其总DNA。

1．5内生真菌种属鉴定及遗传进化分析

1．5．1形态学鉴定采用插片法，即将洗净灭菌的盖玻片斜插于培养基中，使菌丝自然生长于盖玻片上，然后取出载玻片，制作临时装片，以对分离得到的内生真菌进行显微形态观察，根据其菌丝颜色、孢子形态、产孢结构及有无横隔等特征，参照《真菌鉴定手册》对其进行初步鉴定。

1．5．2分子生物学鉴定将刮取的菌丝称重后置于离心管中，利用改良CTAB法［15］提取基因组DNA并作为模板，以真菌rDNA扩增的通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGC－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）为上、下游引物［16］，扩增其核糖体rDNA－ITS保守序列，目的片段经胶回收试剂盒回收纯化后，送交测序公司测序。

1．5．3系统发育树构建将测得的序列利用Blast工具与GenBank中5．8SrDNA－ITS序列进行同源性比对，利用Mega5．0软件分析，采用N－J法构建系统发育树，自展次数为1000次。根据系统发育树中组群关系并结合形态学观察结果确定菌株属种。

1．6多样性计算生物多样性测定主要有3个空间尺度：α多样性、β多样性和γ多样性。α多样性主要关注局域均匀生境下的物种数目，因此也被称为生境内的多样性（Within－habitatdiversity）；β多样性指沿环境梯度不同生境群落之间物种组成的的相异性或物种沿环境梯度的更替速率，也被称为生境间的多样性（Between－habitatdiversity）；γ多样性描述区域或大陆尺度的多样性，是指区域或大陆尺度的物种数量，也被称为区域多样性（Regionaldiversity）。本试验由于只涉及到生境内多样性，故选用α多样性。常用的α多样性指数有香农－维纳指数（Shannon－WeinerIndex，H）、辛普森多样性指数（Simpson’diversityindex，D）等。通常情况下，草类植物内生真菌多样性多使用香农－维纳指数分析［17］。为确保分析结果可靠，本次试验除选用香农－维纳指数外，还选用辛普森多样性指数和均匀度指数（Evennessindex，J）进行多样性分析。其计算公式分别为：H＝－S（Pi）（lnPi）、D＝1－S（Pi）2，式中Pi均为属于种i的个体在全部个体中的比例；J＝H／lnS，式中H为辛普森指数、S为物种总数目。

2结果

2．1内生真菌的分离与鉴定在不同的培养条件下，629块植物组织样品共分离得到433株内生真菌，总分离率为68．84％。其中，茎的分离率为83．03％（230／277），叶的分离率为57．67％（203／352），两者差异显著。其中，不同的培养条件分离率不同，黑暗培养条件下分离率为72．54％，光照培养条件下为66．49％，PDA培养基上为72．70％，BDA培养基上为65．23％。分离所得的433株内生真菌经形态学和分子生物学鉴定分属于10科17属28种，有11株在培养过程中未产生菌丝或菌丝量极少，无法确定其种属。不同的培养条件下分离种类不同，黑暗培养条件下分离种类为21种，光照培养条件下为14种，PDA培养基上为15种，BDA培养基上为20种。表1列举了本次试验分离得到的全部菌株种属分布及分离率统计。总体而言，Undi－filumOxytropis为优势菌株。

2．2内生真菌系统发育分析由图1可以看出，分离所得的内生真菌根据进化亲缘关系可分为种群Ⅰ和种群Ⅱ，种群Ⅰ又可进一步分为种群A、种群B、种群C和种群D，种群A和B的自检支持率分别为95％和97％，种群Ⅱ即为种群E。种群A部分内生真菌亲缘关系较低，自检支持率分别为26％。显微观察结果显示，种群A、种群B和种群C中的链格孢属（Alternaria）为深色有隔菌，种群C剩余部分、种群D和种群E为浅色有隔菌。

2．3内生真菌种群多样性指数计算将分离所得的菌株数量转换成矩阵，通过多样性指数计算公式进行香农－维纳指数、辛普森多样性指数和丰富度指数的计算。结果显示，香农－维纳指数（H）为1．99，均匀度指数（E）为0．60；辛普森指数（D）为0．257.

3讨论

路浩等［18］从采集自青海和内蒙的5种疯草中分离得到小双胞腔菌、层出镰刀菌、拟青霉菌、子囊菌、球状茎点霉菌、细链格孢菌、砖红镰刀菌、三线镰刀菌、焦曲霉和褶皱裸孢壳菌10种内生真菌，赵清梅等［19］从宁夏苦马豆中分离得到枝顶孢属及未定属4种内生真菌，陈基萍等［20］从小花棘豆、黄花棘豆、甘肃棘豆、急弯棘豆、兰花棘豆和变异黄芪中分离得到38种内生真菌，分属于12科19属，可见我国疯草内生真菌种类丰富。但是，前人的研究只使用了1种培养基（PDA），本次试验中使用PDA和BDA（豆芽糖琼脂培养基）2种培养基，结果发现PDA上共分离得到15种内生真菌，BDA上则为20种，特别是在慢生型内生真菌方面，BDA更具优势。这可能是因为BDA培养基营养更加贫乏，快生型内生真菌生长受到了一定程度的抑制。本次试验使用了不同的培养条件（黑暗和光照）以及不同培养基（PDA和BDA），因此分离得到了更多的内生真菌（28种）。内生真菌在宿主植物内经过长期的进化和演变，其形态学特征必然发生某些改变以便适应宿主植物提供的内生环境，而且内生真菌已经适应植物组织内部的特殊生长环境因而对新的培养环境比较敏感，因此，在研究多样性方面，使用不同的培养条件是非常有必要的。本试验发现甘肃棘豆内生真菌优势菌株为UndifilumOxytropis，这与国外的研究相似。国外有研究表明［21］，在缺水和缺钾等条件下，UndifilumOxytropis的含量有所增加。本试验样品采集地位于青海省祁连县，属大陆性高寒山区气候，年均气温1℃，年降水量为270～600mm，气候恶劣，UndifilumOxytropis能增加疯草的抗性，因此分离出来的数量更多。通过构建内生真菌系统发育树发现，有些树枝上自检支持率比较低。一般来说，自检支持率大于50％，则数值会被绘制在发育树上，而自检支持率小于50％和任何指定的下界之间，则数值将以表格输出来决定。对每个种的内生真菌显微观察结果可知，在半干旱草原中，深色有隔菌株占优势地位，这与Khidir等［22］的研究结果相似。在进化树中，与UndifilumOxytropis相近的种属为Alternaria和Macrospora。相对而言，Alternaria属（链格孢属）研究较多。链格孢属真菌广发分布于自然界，可在低温潮湿的环境下生长繁殖，可产生70多种有毒代谢产物链格孢毒素［22］，这些毒素对UndifilumOxytropis合成苦马豆素是否有影响，还有待进一步的研究。多样性指数中，香农－维纳指数用来估算群落多样性的高低，当群落中只有1个居群存在时，香农－维纳指数达最小值0，当群落中有2个以上的居群存在，且每个居群仅有1个成员时，指数达到最大值lnk；均匀度指数用来描述物种中的个体的相对丰富度或所占比例；辛普森指数也是用来估算群落多样性的高低，当全部个体属于1个种的时候辛普森指数为最小值0，当个体属于分别属于不同种的时候辛普森指数达最大值Dmax。与香农－维纳指数相比，稀有物种在辛普森指数中所起作用较小，而普遍物种所起的作用较大。本试验中香农－维纳指数（H）为1．99，均匀度指数（E）为0．60，辛普森指数（1／D）为0．257。目前国内外尚无疯草内生真菌多样性指数的研究报道，因此无法与疯草类植物内生真菌多样性指数相比。与类似气候条件相比（半干旱草原），疯草内生真菌多样性较低=。原因可能有：首先，研究植物不相同；其次，Khidir等=和Porras－Alfaro等=研究的是根部，而本试验是甘肃棘豆的茎和叶部；再次，植物内生真菌多样性与地区、气候、海拔等=有关，尽管两地的气候条件相似，但是海拔等因素略有差异，因此指数有所差异。为更好的研究甘肃棘豆内生真菌种群多样性，为今后的更进一步研究奠定基础，有必要采集更多的样品，通过多次重复分离来获得更多可培养内生真菌，只有这样，才能更好的分析其多样性，从而更好地了解甘肃棘豆及其内生真菌与生态环境之间的关系。本试验对甘肃棘豆内生真菌多样性进行分析，并进行多样性指数的计算，其结果可为今后深入探讨不同地域研究甘肃棘豆内生真菌多样性提供理论依据，也为进一步阐明我国甘肃棘豆内生真菌种群分布特征及遗传多样性奠定基础，为产苦马豆素菌株的筛选提供了丰富的后备菌株。

作者：路浩李国中杨晓雯曹丹丹薛瑞旭权海云赵宝玉单位：西北农林科技大学动物医学院内蒙古阿拉善左旗兽医站