牛源大肠杆菌毒力基因的检测范文

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《中国兽医科学杂志》2014年第八期

1材料与方法

1．1试剂、菌株、实验动物及仪器萘啶酮酸（Nalidixicacid），溴化乙锭（EB）均为Sigma公司产品。rTaqDNA聚合酶等PCR反应试剂均为宝生物工程（大连）有限公司产品。标准菌株大肠杆菌CICC21530由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。普通昆明小鼠，5周龄，雌性：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。超净工作台由上海博讯实业有限公司生产。Bio－RadModel1000／500型电泳仪：Bio－Rad公司生产。2720ThermalCyclerPCR扩增仪由美国ABI公司生产。ChampGel全自动凝胶图像处理系统由北京赛智创业科技有限公司生产。

1．2EHECO157∶H7菌株DNA模板的提取将EHECO157∶H7菌株接种在5mLBHI液体培养基中，37℃振荡18h。吸取1．5mLBHI培养基，以10000r／min离心2min。菌泥加入100μL无菌蒸馏水孵育10min，放置在冰盒上冷却5min，混合物以10000r／min离心2min。移除悬液并于－20℃储存，作为DNA模板用于之后的PCR分析［6］。

1．3EHECO157∶H7菌株毒力基因的检测利用提取的分离菌株DNA模板分别对stx1、eaeA、hly、stx2、F4、k99、F17共7种毒力基因进行PCR检测，反应引物见表1。以标准菌株大肠杆菌CICC21530作为阳性对照。扩增产物在10g／L琼脂糖凝胶进行电泳（1×TAE，EB染色，20min，120V），凝胶影像用凝胶成像仪进行照相。

1．4大肠杆菌O157∶H7菌株的毒力试验小鼠饲养在无菌环境下，饲喂灭菌鼠粮和水。选择36只雌性小白鼠（体重20g±5g），随机将其分成6组，小鼠在腹腔注射前第2天饮水中添加萘啶酮酸（50μg／mL），接种前第24小时禁食，每只小鼠腹腔接种菌液0．5mL，浓度梯度为1．0×1010、1．0×109、1．0×108、1．0×107、1．0×106CFU／mL，共5个梯度。对照组注射等体积的生理盐水。根据各组的死亡情况，依照改良寇氏法计算最小致死量（MLD）与半数致死量（LD50）。

1．5大肠杆菌O157∶H7菌株的致病性试验将大肠杆菌O157∶H7菌株接种于BHI培养基中，37℃振荡24h，倍比稀释后，均匀涂布于LB固体培养基，进行菌落计数。根据计数结果，细菌悬液用生理盐水稀释到1．0×1010CFU。小鼠在腹腔注射前第2天饮水中添加萘啶酮酸（50μg／mL），在接种前第24小时禁食，每只小鼠腹腔接种菌液0．2mL（1．0×1010CFU），对照组注射等体积的生理盐水。接种后24h内观察各组小鼠的死亡情况。

1．6患病小鼠的组织学检查小鼠被处死之后，立即解剖，分离肺、肾、肠道、脾、心脏和肝，并检查显而易见的病理变化。对病理组织在含40mL／L甲醛的PBS中固定24h，进行脱水处理，石蜡包埋，做4μm厚的连续切片，HE染色并用光学显微镜进行观察。

2结果

2．1分离菌株毒力基因的检测毒力基因的PCR检测结果表明，stx1、eaeA、hly三种毒力基因均为阳性（见图1）。

2．2大肠杆菌O157∶H7菌株的毒力试验小鼠腹腔注射0．5mL（1．0×1010CFU）大肠杆菌O157∶H7，18h后前三组开始出现死亡现象，注射后第48小时第4组出现死亡现象，第5组没有死亡现象（见表2）。根据各组小鼠的死亡数计算出的最小致死量和半数致死量分别为5．0×106CFU和7．9×107CFU。

2．3大肠杆菌O157∶H7菌株的致病性试验小鼠在接种后第7小时出现全身症状，包括嗜睡、厌食、脱水、无尿、被毛散乱、呼吸急促，但没有发展为神经症状，至第18小时全部死亡。对照组小鼠无异常症状。死亡小鼠剖检后病变主要为：肺、心脏、肾、肝均有不同程度的肿大或出血；肺部切面呈暗红色，小肠有明显的黄色黏稠积液，肠黏膜充血，肠腔扩张，肠壁变薄、透明。脏器细菌回归检测，阳性率为100％。

2．4组织学检查致病小鼠的心脏肿大，心耳淤血。病理组织学检查发现，心肌纤维断裂，肌细胞破裂。间质充血，心脏动、静脉淤血（见图2A）。肝眼观出血点明显，淤血，体积增大，切面脆弱呈颗粒状。组织学检查时肝门静脉淤血严重，上皮细胞坏死、脱落，少量肝细胞坏死，细胞核碎裂，细胞质溶解，间质有红细胞浸润（见图2B）。小鼠脾暗红色，病理组织学检查时可见有多量红细胞浸润（见图2C）。肺眼观淤血，颜色变深，有出血点，肿大。病理组织学检查时发现细支气管上皮细胞变性、坏死，核仁溶解，管腔中观察到脱落的上皮细胞。肺泡扩张，充血，肺泡隔增厚，间质淤血（见图3A）。肾颜色苍白，水肿，病理组织学检查发现肾小球上皮细胞肿胀、破裂，细胞变性但未观察到坏死，细胞质疏松，肾小管细胞肿胀，管腔变窄，细胞破裂（见图3B）。小肠肠壁变薄，透明、肿大有气泡，血管充血，肠腔内充满黄色液体，尤其以十二指肠最为严重。十二指肠病理组织学观察可见，固有层变薄，局部上皮细胞坏死、脱落，杯状细胞破碎，胞质疏松，细胞脱落，无完整结构，可以观察到有少量细胞核溶解，轻度炎性细胞浸润（见图3C）。对照组小鼠未观察到病理组织学变化。

3讨论

据WHO估计，1982－2005年美国每年有250人死于大肠杆菌O157∶H7，英国、法国等国都有出现人感染后的死亡现象［9］。O157∶H7具有较强的感染力，一般大肠杆菌需要100万个活菌才可引起发病，而O157∶H7只需100到200个活菌即可突破胃酸屏障，引发感染。各年龄段人群对O157∶H7都易感，但儿童和老年人最易发病且症状较为严重。临床资料统计表明，EHEC的潜伏期通常是3～4d，感染患者大多急性发病，常突然发生剧烈腹痛和非血性腹泻，数天后出现血性腹泻，低热或不发热，表现为水样便、黏液便或脓血便。大肠杆菌O157∶H7具有多种毒力因子，但在长期的进化过程中，毒力因子也存在从其他菌株获取或缺失的现象，导致部分大肠杆菌O157∶H7毒力的改变。丧失毒力的大肠杆菌O157∶H7在生化特性、血清学试验中与其他大肠杆菌O157∶H7的表型几乎完全一致。因此，传统的流行病学调查并不能展现出大肠杆菌O157∶H7的毒性与威胁程度，对分离菌株进行毒力因子的检测具有重要意义。人类感染大肠杆菌O157∶H7后，发病与sstx1、tx2等致病基因有关。爱尔兰、西班牙、芬兰、阿根廷等经常有大肠杆菌O157∶H7的暴发或散发，分离的大肠杆菌O157∶H7菌株大部分携带stx1、stx2、eaeA基因。本试验在采取的病料中成功地分离出1株出血性大肠杆菌O157∶H7。根据文献的报道，笔者主要针对stx1、stx2、eaeA和hly等4种毒力基因以及F4、F17、K99菌毛进行检测。

PCR检测结果表明，该菌株含有stx1、hly、eaeA三种毒力基因，从而使该菌株有一定的致病性。可见，在不同条件下分离的出血性大肠杆菌O157∶H7含有的毒力基因的种类有所不同，并且产生不同的致病能力。国内外相关研究表明，成年的IQI、BALB／c、昆明小鼠等对O157∶H7均不易感［11］。陈亢川等［12］以大肠杆菌O157∶H7经腹腔注射感染小鼠，出现了临床症状及死亡。孙洋等使用丝裂霉素和萘啶酮酸处理的小鼠，经口服途径感染O157∶H7，出现了主要病理变化和部分临床症状。但这些试验均未摸索出大肠杆菌O157∶H7的半数致死量，为后续的研究带来了不便。本试验在小鼠饮水中加入萘啶酮酸（50μg／mL），萘啶酮酸抑制了小鼠体内的正常菌群，增强了分离菌株对小鼠的易感性。经过腹腔注射活菌的小鼠在1～5d内发病、死亡，利用改良寇氏法测算出大肠杆菌O157∶H7的半数致死量要比谢运冰等报道的偏高，可能与环境或其他原因有关。

LD50的测定使其与其他不同菌株或疫苗菌株的比较有了一个准确的剂量参照，为进一步研究奠定了基础。EHECO157∶H7感染所引起的经典的组织病理学变化包括肠黏膜固有层的出血和水肿，结肠活检标本会显示出中性粒细胞浸润，典型的人肾组织病理学变化包括肾小球内皮细胞肿胀和血小板及纤维素在肾小球的沉积。有报道称，用EHEC感染无菌猪、链霉素处理的老龄鼠、幼兔可以引起消化道病变及神经系统疾病或者死亡，然而，这些动物模型并未观察到出血性结肠炎和肾小球的病理变化［15］。本研究中患病小鼠症状显示肾病变以水肿和无尿为主，肾的病理变化主要集中于肾小管和肾小球上皮细胞破裂，胞质疏松。感染引起肠管各层结构受到严重破坏，黏膜坏死、脱落，血管充血，肠壁变薄，细胞脱落，无完整结构，尤其以十二指肠最为严重。结肠未出现显而易见的病理变化，可能与使用萘啶酮酸处理小鼠有关。患病小鼠出现呼吸急促，剖检后发现肺有出血点、肿大，病理变化显示支气管上皮细胞变性、坏死，肺泡扩张、充血、出血。本研究结果表明，幼龄小鼠经萘啶酮酸处理，提高了幼龄小鼠对EHECO157∶H7的敏感性，从而观察到了明显的病理学变化，为进一步研究EHECO157∶H7的致病特性以及毒力因子在致病特性中所发挥的作用奠定了试验基础。

4结论

EHECO157∶H7黑龙江分离株毒力较强，可造成小鼠肺、肝、肾、心脏、脾以及小肠出现不同程度的出血及细胞变性、坏死，其中对肺泡、肾小球、肾小管以及十二指肠的破坏力最为严重。

作者：张力国卢婷赵明礼梁伟峰孙冬冬孙思超周国辉师东方于力刘云单位：东北农业大学动物医学学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所