猫钩虫PCR检测方法范文

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《中国兽医科学杂志》2014年第八期

1材料与方法

1．1粪样和对照样品本研究所用的112份流浪猫粪样采自广州市某宠物救助站。阳性对照样品巴西钩虫为美国诺华动物保健有限公司StephenEBienhoff博士赠送。阳性对照样品犬钩虫和锡兰钩虫以及阴性对照样品猫弓首蛔虫、犬复孔绦虫、狐毛尾线虫虫卵，蓝氏贾第虫包囊、猫等孢球虫卵囊均为华南农业大学寄生虫病教研室保存。

1．2主要试剂粪便DNA提取试剂盒为OMEGA公司产品。UNIQ－10柱式pcr产物纯化试剂盒为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。ExTaqDNA聚合酶、pMD18－T载体及JM109感受态细胞均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1．3显微镜检查在待检的猫粪样品中加入2倍体积的蒸馏水搅匀，0．246mm的筛网过滤1次，吸取1～2mL过滤液于5mL离心管中，加入2倍体积蒸馏水，4000r／min离心5min，弃上清液，加入2．5mL33．3g／L的硫酸锌溶液，搅匀，1500r／min离心3min，再加入33．3g／L的硫酸锌溶液直至加满离心管，其上放置一盖玻片，静置5min后，移开盖玻片，放置于载玻片上，卢戈氏碘液染色，在40×10倍镜下检查。

1．4粪便DNA的提取吸取1．3中的粪便过滤液1．5mL于2mL离心管中，4000r／min离心5min，弃上清液，加入适量的玻璃珠并在－80℃和100℃中反复冻融5次，然后加入适量的缓冲液和蛋白酶K，漩涡振荡30min，55℃消化16h。之后，按照粪便DNA提取试剂盒使用说明书提取虫卵基因组DNA。

1．5PCR反应条件的优化扩增引物为钩虫ITS部分序列的保守引物AF：5′－CTTTGTCGGGAAGGTTGG－3′和AR：5′－TTCACCACTCTAAGCGTCT－3′［12］，预期扩增片段的大小为404bp。PCR反应体系（25μL）为：10×Buffer2．5μL，dNTP5nmol，上、下游引物各25pmol，ddH2O17．3μL，模板2μL，ExTaqDNA聚合酶0．2U。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，51．9～69．5℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃后延伸7min。根据不同退火温度下目的条带的亮度确定最佳退火温度。

1．6特异性试验按照1．5中的最佳退火温度，分别取锡兰钩虫、犬钩虫、巴西钩虫和阴性对照的基因组DNA2μL作为模板，同时设立灭菌双蒸水作为空白对照进行PCR扩增，重复2次，检测该方法的特异性。

1．7敏感性试验测定提取的钩虫虫卵基因组DNA浓度，然后按10倍倍比连续稀释，每个倍数稀释样品取2μL作为模板进行PCR扩增，重复2次，检测该方法的敏感度。

1．8PCR方法的临床检测对112份流浪猫粪样进行3次碘液染色镜检，同时提取粪便DNA进行PCR检测，比较两种方法的检出率。以3次镜检作为猫钩虫病诊断的金标准，按照诊断试验真实性评价方法计算PCR方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。计算方法如下：敏感度＝真阳性／（真阳性＋假阴性）；特异度＝真阴性／（假阳性＋真阴性）；阳性预测值＝真阳性／（真阳性＋假阳性）；阴性预测值＝真阴性／（假阴性＋真阴性）。PCR扩增后，随机抽取5个阳性样品进行切胶并按照胶回收试剂盒说明书回收纯化PCR产物，将纯化产物连接到pMD18－T载体上，连接之后的载体转入JM109感受态细胞中，然后将连接产物均匀涂布于含有氨苄青霉素、IPTG和X－gal的固体营养琼脂培养基上，37℃培养过夜后挑取单个菌落，37℃摇床培养6h，菌液PCR鉴定，将含有目的片段的菌液送至北京华大生物技术有限公司测序。

2结果

2．1PCR最佳退火温度的筛选温度梯度PCR扩增的电泳结果显示，退火温度为61．2℃时扩增效果最好（见图1）。

2．2特异性试验特异性PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，只有钩虫的基因组DNA样品扩增出404bp的条带（见图2）。

2．3敏感性试验经核酸测定仪测定，钩虫虫卵基因组DNA的质量浓度为107．2μg／mL。重复试验显示，该反应体系的最低检测限为1∶108的稀释度，即最低可检测1．07fg钩虫虫卵基因组DNA（见图3）。

2．4临床初步应用两种方法的检测结果显示，镜检法第1次的检出率为34．8％，3次的检出率为43．8％；PCR方法一次的检出率为43．8％（见表1）。以3次镜检作为猫钩虫病诊断的金标准，根据公式计算，得出该PCR检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为100％。测序结果显示，5个随机样品的序列长度均为404bp，同源性比对发现，1个序列（登录号：KJ840829）与GenBank中收录的1株锡兰钩虫ITS序列（登录号：KF279136）的一致性为99％，另外4个序列（登录号：KJ840825～KJ840828）与1株犬钩虫ITS序列（登录号：KC755025）的一致性均为99％。

3讨论

猫钩虫是一种土源性寄生虫，其感染性幼虫在适宜的外界环境中可存活数周，污染环境，造成宿主反复感染，对犬猫和人类的健康构成潜在威胁。目前大多采取化学防治的防控措施，但药物治疗对钩虫的再次感染影响甚微，并且长期的药物驱虫使得轻度感染越来越普遍，造成粪便镜检的漏检率升高。采用重复粪便镜检虽然可以提高检出率，但费时费力，特别是对于大规模的钩虫病流行病学调查时，过长的镜检还会引起粪便中虫卵的变形或溶解。因此，急需建立一种适合临床使用的钩虫敏感、特异、快速的检测方法。内转录间隔区（internaltranscribedspacers，ITS）是介于核糖体18S、5．8S和28SDNA之间的区域。多项研究表明，ITS序列可以作为钩虫的分子标记与其他寄生虫进行区分。因此，本研究根据钩虫ITS部分序列的保守引物建立了猫钩虫的PCR检测方法。特异性试验中只有猫钩虫扩增出目的条带，猫的其他常见寄生虫没有扩增产物出现。

在敏感性试验中，最低检测到1．07fg钩虫基因组DNA。上述结果表明该方法具有较高的特异性和敏感性。在对112份临床猫粪的检测中，PCR方法的检出率比首次粪便镜检高9％，而与重复3次的镜检结果一致。近年来，越来越多的PCR检测技术已应用于人钩虫病的诊断，显示了较高的敏感性和特异性。Schr等比较了粪便镜检法和PCR方法对人体钩虫的检出率，结果PCR方法的检出率比粪便镜检法高11％。Wang等应用粪便镜检法和两种PCR方法同时对人粪便中的美洲钩虫进行检测，结果显示两种PCR方法均较粪便镜检法敏感。本试验中，以3次镜检作为猫钩虫病诊断的金标准时，PCR方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均达到了100％。5个随机样品的测序结果显示序列长度均为404bp，同源性比对发现5个序列与GenBank中收录的锡兰钩虫和犬钩虫的ITS序列一致性达99％，说明扩增结果正确。另外，该方法运用试剂盒，仅对粪便进行简单处理即可快速简便地提取粪便中的钩虫虫卵DNA，提高了检测效率。临床初步应用结果说明，该方法适用于钩虫病的流行病学调查和临床诊断。

作者：胡伟刘远佳郑国超谭立娉罗琴李国清单位：华南农业大学兽医学院