猪小肠淋巴结菌群的特点范文

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《中国兽医科学杂志》2014年第八期

1材料与方法

1．1动物来源试验所用猪共分为2个品种：长白猪，饲养于江苏省农业科学院和中国科学院亚热带研究所（湖南长沙）；巴马香猪，饲养于江苏省农业科学院。饲料中均不含有抗生素和微生物类添加剂，基本信息见表1。

1．2主要试剂细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。DNA凝胶回收试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1．3样品采集

1．3．1采集方法试验前禁食1d，正常饮水。称取试验猪体重，应用麻醉剂舒泰肌肉注射，麻醉剂量为8mg／kg，待猪处于深度麻醉后进行放血致死，尽快打开腹腔，分离肠段，分别选取含有PPs和不含有PPs的回肠段，避开连接肠系膜的血管，将其结扎为小段，1．5～2．0cm长，尽快剪取肠段并放入无菌生理盐水中保存。

1．3．2样品处理超净台中剪开肠段，分离出PPs，将其放入无菌平皿中用无菌生理盐水进行清洗，摇床上涮洗10次，每次5min，以除去黏附于外部的肠内容物和细菌。应用组织匀浆器对PPs进行匀浆后，500r／min离心10min以除去组织碎片。收集上清，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，0．01mol／L，pH7．2）稀释至适当浓度后备用。对于不含PPs的回肠，剪取和PPs大小相同的肠段进行清洗和匀浆，操作同上。

1．4细菌的分离纯化与培养取100μL组织上清稀释液涂板，接种于血平板中，37℃恒温箱倒置培养20h。根据平板上菌落的生长形态、大小、颜色、气味、溶血性等进行分类，挑取每一类典型菌落接种于液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜后，划线接种于固体LB培养基上，37℃恒温箱倒置培养20h，直至长出单菌落并进行革兰染色镜检，初步区分革兰阴性菌与阳性菌。为了说明肠腔中的细菌已被清洗干净，同时取100μL最后一次组织涮洗液，以相同的方法进行涂板培养，以无细菌生长为准。1．5分子生物学鉴定分离纯化细菌后，应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA（操作步骤详见说明书）。利用细菌通用引物（上游引物：5′－AGAGTTT－GATCGTGGCTCA－3′；下游引物：5′－TACGGT－TACCTTGTTACGACTT－3′）扩增16SrDNA基因片段，预期扩增的目的片段长度为1500bp。反应体系：2μL模板DNA，25μLMix，2μL上游引物，2μL下游引物，ddH2O补足50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1．5min，30个循环；72℃终延伸10min。反应结束后取5μL扩增产物，用10g／L琼脂糖凝胶（含0．5μg／mL溴化乙锭）电泳检测PCR产物。在紫外灯下观察，用数字凝胶成像系统记录试验结果。将阳性PCR扩增产物应用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后（详见说明书）送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

2结果

2．1细菌16SrDNA基因的同源性分析对分离菌株的16SrDNA基因PCR扩增产物进行10g／L琼脂糖凝胶电泳，在1500bp处均出现符合大小的目的条带（见图1），将PCR产物回收并测序。并将本次测序结果与GenBank中参考菌株16SrDNA基因的核苷酸序列进行同源性比对分析。结果发现，分离菌株与GenBank中参考菌株具有较高同源性，均在97％以上。根据不同属细菌16SrDNA基因同源性为70％～90％，而同一种内不同株间基因同源性大于99％的判定标准，证实分离株的16SrDNA基因序列均与各自种属的16SrDNA基因序列相一致，确证是各自种属的细菌。

2．2细菌分离鉴定

2．2．1PPs黏膜处的菌群从20头试验猪的PPs中共分离得到43株细菌（见表2）。其中，大肠杆菌18株，枯草芽胞杆菌7株，蜡样芽胞杆菌3株，巴氏杆菌、地衣芽胞杆菌、李氏杆菌、猪链球菌各2株，短小芽胞杆菌、科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠鼻罗氏菌、豚鼠气单胞菌、痢疾志贺菌、奇异变形杆菌各1株。分离菌株的培养特性及形态特征见表3．

2．2．2其他黏膜处的菌群随机选取5号、6号、7号、17号、18号、19号、20号猪的不含PPs的回肠黏膜段，按照上述方法进行分离鉴定，结果见表4。从7头猪中共分离到8种细菌，其中，大肠杆菌5株，克雷伯菌3株，猪链球菌2株，奇异变形杆菌、嗜水气单胞菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、痢疾志贺菌、蜡样芽胞杆菌各1株。

2．2．3PPs和其他黏膜处菌群的比较比较5号、6号、7号、17号、18号、19号、20号猪PPs和其他黏膜处细菌种类发现（见图2），PPs处和其他黏膜处的细菌种类和数量存在差异：其中，大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌和痢疾志贺菌为两者共有细菌；而地衣芽胞杆菌只存在于PPs中，克雷伯菌、嗜水气单胞菌、解鸟氨酸拉乌尔菌和猪链球菌只在其他黏膜中检测得到。

3讨论

口服免疫不仅可以有效地诱导消化道黏膜免疫应答，而且能够通过共同黏膜免疫系统同时加强呼吸道等黏膜处的免疫应答水平。随着养猪业的不断发展，猪的口服免疫研究近年来也逐渐受到重视。口服减毒的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）不仅可以增加猪肠黏膜相关淋巴样组织（GALT）中抗体分泌细胞的数量、减少病毒的复制，还可以有效降低猪呼吸冠状病毒（PRCV）的感染概率。大量的研究表明，PPs在消化道免疫中发挥重要功能，不仅表面分布着具有胞吞转运抗原功能的M细胞，其内部（固有层）也分布有丰富的树突状细胞、T细胞和B细胞。Bailey等发现猪小肠黏膜中的CD45RC－NaveT淋巴细胞和记忆性T淋巴细胞主要来源于PPs。可见，PPs是主要的消化道黏膜免疫诱导位点。因此，设计合理的靶向PPs的口服递送疫苗，对于消化道黏膜免疫研究的突破具有潜在价值。作为黏膜相关淋巴组织的扁桃体是许多病原微生物的入侵位点和藏身之处，如人HIV－1、朊病毒（PrPSc）、猪链球菌2型（SS2）［20］等。PPs是否也可作为病原微生物入侵机体的门户同样受到关注。有报道发现，一些病原菌通过黏附或者破坏PPs的M细胞入侵机体，如耶尔森菌、沙门菌等。Chassaing等发现，具有长的极性化菌毛（LPF）的黏性侵袭性大肠杆菌（AIEC）通过破坏PPs侵入机体，引起肠道克罗恩病。值得注意的是，本试验中PPs黏膜中大肠杆菌的检出率最高，为90．00％。而大肠杆菌是人类和动物肠道中的正常菌群，多不致病，但仍存在部分具有较强致病性的血清型，如肠产毒素型大肠杆菌（enterotoxigenicE．coli，ETEC），可引起较为严重的腹泻。因此，笔者推断，如此之多的大肠杆菌在PPs中存在可能有两方面的原因：致病性大肠杆菌利用PPs入侵机体并抑制机体的免疫应答功能；非致病性大肠杆菌在PPs中大量定植，与PPs共同发挥免疫保护作用。但由于本试验中采用的16SrDNA基因片段PCR扩增技术只能鉴定到种的水平，尚不能确定分离到的菌株的致病力，所以对于大肠杆菌在PPs中大量存在的具体原因仍需进一步研究。

有趣的是，本试验中发现在猪的PPs黏膜处枯草芽胞杆菌数量较多，检出率仅次于大肠杆菌；而地衣芽胞杆菌也只在PPs中存在。两者虽然不是猪肠道内的固有菌群，但却在土壤和空气中大量存在。而猪的行为学本能如拱土可能使这两种细菌在长期进化中逐渐具备了肠道固有益生菌的典型特点。有研究已证实，作为兼性厌氧菌，枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌的孢子可以在肠道内存在一定时间。Leser等用枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌的孢子饲喂猪，发现在饲喂24h后，仍能在猪的胃肠道内检测得到。在动物养殖上，枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌作为饲料添加剂近年来也逐步被认可。而随着口服活载体疫苗的不断发展，新的、安全的疫苗递送载体不断被发现，其中，作为饲料添加剂的益生菌更是首选。研究表明，乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌等都是很好的活菌疫苗递送载体。因此，枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌作为靶向猪PPs的益生菌活载体口服疫苗载体，更有应用前景。此外，大肠杆菌作为PPs的优势菌群，尽管存在部分血清型具有致病性的可能，但经过适当的改造重组来减弱毒力，也有望作为一种很好的靶向猪PPs的递送载体。

比较PPs黏膜和其他黏膜处的细菌种类发现，不含PPs的黏膜中存在较多的条件致病菌，如猪链球菌、克雷伯菌、嗜水气单胞菌等，PPs黏膜中虽然也检测到奇异变形杆菌等条件致病菌，但其检出率较低（5．00％）。这可能与PPs的相关免疫功能有关。值得注意的是，在无特定病原小鼠、非人灵长类动物和人上的相关试验表明，PPs内部的共栖菌群大部分是产碱菌属细菌（Alcaligenessp．）。而本试验中从20头猪的PPs中并未分离到产碱菌属细菌，可见，猪PPs内部菌群与其他动物存在差异。这也提示我们，在针对不同动物的同一免疫器官设计靶向疫苗时，应考虑到不同动物的具体特点，选取靶动物、靶器官内部特有的定植菌群，设计针对性强、特异性好的细菌活载体口服疫苗。

作者：王晓青刘浩飞杨倩单位：南京农业大学动物医学院