高原鼠兔体内囊尾蚴分类学研究范文

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《中国兽医科学杂志》2014年第八期

1材料与方法

1．1样品采集与处理本研究中的所有囊尾蚴虫体均采自青海省久治县哇尔依乡。利用捕鼠器对该地区草场高原鼠兔进行捕捉和现场剖检。从腹腔和胸腔内直接将囊尾蚴取出后放置在装有400mL／L绵羊胆汁的离心管内，用手紧握离心管约10min，待囊尾蚴头节完全外翻后，迅速夹取1～10条囊尾蚴放置在含有100mL／L福尔马林溶液的离心管内进行固定。剩余虫体则转移到500mL／L乙醇溶液内，用于基因组DNA的提取。

1．2HE染色首先把浸泡在100mL／L福尔马林溶液中的标本取出，用蒸馏水冲洗1次；放入到苏木精－伊红染色液中染色30s，取出标本，充分水洗；放入到10mL／L盐酸乙醇溶液中分化，取出标本，充分水洗；放入氨水中返蓝，取出标本，充分水洗；用伊红染液染色，充分水洗；然后依次放入到750、800、850、950mL／L乙醇溶液和无水乙醇中进行逐级脱水；用二甲苯透明2次，各5min；最后树胶封固。

1．3cox1基因的系统发育分析在提取DNA前，将所要提取的囊尾蚴虫体放在一个1．5mL的离心管内，利用液氮反复冻融几次，并充分研磨。应用QIAampDNAFFPETissueKit（Qiagen，USA），提取囊尾蚴基因组DNA，并保存于－20℃，备用。从形态学观察结果可以初步断定该囊尾蚴为带属绦虫的幼虫期。依据中间宿主种的特异性，推测该囊尾蚴与豆状囊尾蚴可能存在较近的亲缘关系。利用豆状囊尾蚴cox1基因的保守区序列设计引物进行PCR扩增，上、下游引物序列分别为5′－TTAGGGTTATGGTCTGGT－3′和5′－ATACATAAGTGCAATCATCAAC－3′［23］。为了减少PCR反应过程中发生碱基错配，本研究采用了具有高保真性、高扩增效率的PrimeSTARHSDNAPolymerase（TaKaRa，日本）。PCR反应体系为：DNA聚合酶0．5μL，5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTP4μL，上、下游引物各1μL（50pmol／L），模板1μL，ddH2O33．5μL。反应条件为：96℃4min；98℃10s，55℃10s，72℃2min，共35个循环；72℃15min。PCR产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，送金唯智生物科技（北京）有限公司采用步移法进行序列测定。将获得的cox1基因核苷酸序列与NCBI数据库中已录入的其他带属绦虫的cox1基因序列进行相似性搜索并下载相关序列，通过MEGA5．1软件中ClustalW程序进行多序列比对；利用邻接法（Neighbor－Joining，NJ）和最大似然法（MaximumLikelihood，ML）构建分子系统发育树，进化树检验用自展法（Bootstraptest），选择1000次重复。选择同样以高原鼠兔为中间宿主的棘球属的多房棘球绦虫（Echinococcusmultilocularis）和石渠棘球绦虫（E．shiquicus）作为外群，以确定该囊尾蚴在带属绦虫分类学中的地位和亲缘关系。

2结果

2．1样品采集及处理对50只高原鼠兔的解剖结果显示，3只呈囊尾蚴感染阳性，囊尾蚴感染率为6％。囊尾蚴主要寄生于高原鼠兔的腹腔内，偶尔见于胸腔，而颅腔内暂无发现有囊尾蚴寄生，其感染强度分别为4、13和28条。囊尾蚴经400mL／L绵羊胆汁刺激后头节外翻率达100％，表现出很强的生命活性。经100mL／L福尔马林溶液固定后，头节能裸露在囊腔外，便于形态学观察和染色。

2．2囊尾蚴的形态学观察肉眼直接观察到高原鼠兔囊尾蚴的外形呈长条形，囊壁较长且透明，富含囊液，经固定后其长度为33～36mm，幼虫原头节处为乳白色。HE染色后观察头部形态及大小：头部有两圈钩，外圈钩形状较大，内圈钩形状相对较小，隐藏在外圈钩下面，内外两圈钩排列较疏松；有4个吸盘，位于颈节上，直径约100μm（见图1）。2．3cox1基因核苷酸序列的系统发育分析被检囊尾蚴的cox1基因开放性阅读框（openreadingframe）大小为1620bp，在NCBI数据库中的登录号为KM042892。采用NJ法和ML法构建的系统发育树结果均显示，该绦虫与豆状带绦虫（T．pisiformis）处在同一个分支上，两者亲缘关系较近，系统发育树的自展值（Bootstrap）均高达97％（见图2）。从进化树上可以看出，该绦虫与豆状带绦虫的cox1基因遗传差异高达15％左右。因此，笔者认为该囊尾蚴不属于豆状带绦虫或其亚种。

3讨论

到目前为止，尚未见文献报道在我国高原鼠兔有感染囊尾蚴，而青藏高原鼠兔分布广泛，为啮齿动物优势物种。此次流行病学调查表明，高原鼠兔囊尾蚴的感染部位主要集中于腹腔，偶尔见于胸腔。感染强度在不同中间宿主体内存在明显差异。囊尾蚴的形态学观察结果表明，囊壁较薄，透明，含有丰富的囊液，个体长度差异不大。经绵羊胆汁刺激后头节均外翻，并暴露出颈节。HE染色后观察到头节上有两圈钩，外圈钩较长将内圈钩隐藏在内，排列相对疏松；有4个吸盘，吸盘上无钩，稍微突起于颈节表面。被调查囊尾蚴的cox1基因的核苷酸序列与NCBI数据库已登录的序列均不相同。依据线粒体cox1基因构建的系统发育树结构表明，高原鼠兔囊尾蚴与豆状带绦虫在进化上亲缘关系较近，但遗传距离间的差异显示该囊尾蚴并非为豆状带绦虫或其亚种。经对该囊尾蚴形态学观察、中间宿主以及cox1基因构建的系统发育树等结果的综合分析，可以初步确定该囊尾蚴属于一未定新种，并建议将其命名为才氏囊尾蚴（Cysticercuscaixuepengin．sp．或者Taeniacaixuepengilarvan．sp．），对其生物学特性的认识还有待于今后更多数据的支持和深入研究。已有的研究表明，高原鼠兔是多房棘球蚴和石渠棘球蚴的重要中间宿主之一，已成为我国棘球蚴病的重要传染源，对人的卫生健康构成了极大威胁［24－26］。同时，高原鼠兔多房棘球蚴感染情况可作为生态风险安全评估和棘球蚴病防控措施推广效果评价的指标之一。同样，也可考虑将高原鼠兔囊尾蚴感染状况作为有效的评价指标之一。此外，此种囊尾蚴是否感染家畜和人体尚不清楚，它的终末宿主也不清楚，这些问题迫切需要进一步地澄清。人们对带属绦虫幼虫期的中间宿主检测，将有助于了解某一区域内该绦虫蚴病的流行情况。

Mal－sawmtluangi等［10］在印度东北部啮齿动物体内检测到一种囊尾蚴，经对其形态学观察发现，它属于带属绦虫，随后经分子生物学确定其为巨颈带绦虫（T．taeniaeformis）的中绦期幼虫———片状囊尾蚴（Cysticercusfasciolaris）；同样，Kataranovski等［27］在塞尔维亚野生沟鼠体内也发现了该囊尾蚴，并统计其感染率为29．9％。对于那些既感染野生啮齿动物同时又感染经济动物和人的绦虫蚴（例如：连续囊尾蚴，T．serialiscysticercus）［28］，调查其感染啮齿动物的情况将有助于制定对当地经济动物和人群免遭感染的有效保护措施。本研究为我国进一步开展啮齿动物囊尾蚴虫种调查和研究提供了方法，也为开展带属绦虫分子的系统进化研究积累了数据。

作者：范彦雷李立娄忠子闫鸿斌李建秋刘聪暖贾万忠单位：中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室