免疫鸡群马立克病的诊断范文

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《中国兽医科学杂志》2014年第八期

1材料与方法

1．1PCR诊断引物的设计与合成：参照GenBank中MDV1强毒株基因的保守区序列（EU104985），设计了1对特异性引物，P1：5′－TTCCGAGATCGAAGAAGT－GAG－3′，P2：5′－ACTCTGGTGGCAAGTATCCT－GT－3′，预期扩增产物的长度为567bp。该引物由Invitrogen（北京）公司合成。病料处理：取2g肝组织块置于平皿中，用400μg／mL双抗液清洗组织表面数次，剪碎并放入匀浆器中研磨，加入10mLHank’s液（无Ca2＋、Mg2＋），反复冻融3次。4℃8000r／min离心20min，吸取上清，用孔径0．22μm的一次性滤器过滤。随后，按照DNA提取试剂盒的操作说明书对病鸡肝组织器官内的病毒DNA进行提取。PCR检测：取10×Buffer2．5μL，dNTP2μL（各成分浓度均为2．5mmol／L），TaqDNA聚合酶0．2μL（5U／μL），P11μL（10pmol／μL），P21μL（10pmol／μL），DNA模板1μL（7．75×10－2～7．75×10－5ng／μL），ddH2O17．3μL，置于500μLEP管中。反应程序：95℃预变性3min；94℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，进行40个循环；最后72℃孵育5min。最终PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1．2病理组织学观察对中性甲醛溶液固定材料进行常规石蜡切片，苏木精－伊红（HE）染色，并进行AgNOR核仁区嗜银蛋白特殊染色。采用OLYMPUSBX－UCB／BX61型光学显微镜观察和图像分析系统分析。

2结果

2．1琼脂扩散试验8份MDV1标准阳性血清孔与分别加有MDV1标准抗原液的阳性对照孔和待检抗原液孔间均有清晰的沉淀线，而与加有生理盐水的阴性对照孔间均无沉淀线形成，这与预期试验结果一致，证明羽髓中含有MDV1。

2．2PCR诊断PCR检测发现，阴性对照（D2）表现为阴性，阳性对照（D1）和1、2、3、4、5、6、7、8号病鸡组均扩增出567bp的MDV1特异性条带（见图1）。证明病鸡肝组织中含有MDV1，证实该鸡场鸡群是由于感染MDV1引起的MD。

2．3病理学观察眼观：8只病鸡均表现有精神不振，呆立，羽毛松乱和食欲减退的症状，其中6只病鸡有下痢和拉青绿色稀粪症状。多数病鸡表现肢体神经非对称性麻痹，蹲伏地上，不能正常行走，有的呈典型的“劈叉”姿态，有的病鸡表现翅膀下垂，头颈歪斜。8只病鸡眼睛虹膜均有单侧或双侧程度不等的浑浊，瞳孔呈同心环状和斑点状弥漫性灰白色，边缘不整齐，少部分严重病例表现失明状态。8只病鸡心脏的外膜下、冠状沟、心壁和心尖等处均可见单个或多个大小不等的灰白色肿块，质地坚实，心肌纤维颜色变淡。其中，5只病鸡心脏表面有较大的灰白色肿块，致心脏发生变形。8只病鸡肝均呈现不同程度的肿大，被膜紧张，质脆，表面和实质有弥漫性分布的灰白色粟粒大结节病灶，微突出于表面，切面平整。严重病例的肝高度肿大，呈灰白色，占据体腔大部。8只病鸡脾均不同程度肿大（约为正常鸡脾的2～5倍），被膜紧张，表面和切面有弥漫性分布的灰白色粟粒大小结节病灶，切面平整。8只病鸡肺均散在大小不等的灰白色结节性病灶，呈局灶性或弥漫性分布；其中有6只病鸡肺有较大的灰白色结节灶，正常肺结构破坏，病灶质地较坚748中国兽医科学第44卷实。8只病鸡肾有程度不等肿大，颜色程度不等变淡。8只病鸡腺胃胃壁均程度不等肿厚，质地较硬，部分病鸡胃壁切面有灰白色肿块。个别病鸡肌胃胃壁也程度不等增厚，质地较硬，切面有局灶性和弥漫性分布的灰白色病灶。8只病鸡坐骨神经均有程度不等的单侧性肿粗，病变坐骨神经弹性降低或丧失，色灰白或黄白。其中，3只病鸡病变坐骨神经部形成大小不等的灰白色串珠状结节。镜下：8只病鸡病变局部变化特征基本一致。病鸡各脏器弥漫性和／或局灶性增生的灰白色病灶均由肿瘤化的大小不等的多形态的大、中、小淋巴细胞，成淋巴细胞，浆细胞，网状细胞和MD细胞组成。肿瘤细胞核不规则，并可见大量异常的核分裂相。尤其MD细胞，体积较大，核有明显异常分裂相，胞质内有空泡，呈强嗜碱性，在各病灶区均有数量不等的分布。心脏，瘤细胞可局灶性或弥漫性浸润于心肌纤维间，周围心肌纤维变性、坏死，严重时心肌纤维可被肿瘤细胞取代（见图2A）。

作者：孙宝高欣贾宁单位：甘肃农业大学动物医学院