食物中毒的病原分离鉴定范文

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《中国食品卫生杂志》2016年第一期

摘要:

目的通过对食物中毒病原菌的分离鉴定，为查明中毒原因提供科学依据。方法分离鉴定和毒性试验按照国家标准方法WS/T12—1996《椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒诊断标准及处理原则》和GB/T4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》进行。米酵菌酸检测按照GB/T11675—2003《银耳卫生标准》执行，采用液相色谱-质谱联用法对样品开展检测。结果经VITEK2COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和基因指纹鉴定仪进行鉴定，4份样品中3份鉴定结果为唐菖蒲伯克霍尔德菌，小鼠毒性试验阳性。4份样品均检测出米酵菌酸。结论本次食物中毒源于食源性椰毒假单胞菌酵米面亚种污染。

关键词:

椰毒假单胞菌酵米面亚种;食物中毒;鉴定;米酵菌酸;食源性致病菌;云南

椰毒假单胞菌酵米面亚种(以下简称椰酵假单胞菌)食物中毒，是我国发现的一种病死率很高的细菌性食物中毒，病死率高达68%～89%，死亡人数占食物中毒死亡总人数的23%以上［1］。由椰酵假单胞菌引起的食物中毒流行区域广，我国已有16个省陆续发现了由椰酵假单胞菌引起的中毒。引起此类中毒的食品种类繁多，大致可分为3大类，即谷类发酵制品(发酵玉米面、糯玉米汤圆粉、玉米淀粉、发酵糯小米、醋凉粉等)，变质银耳及薯类制品(马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)［2］。由椰酵假单胞菌引起的食物中毒在云南也偶有发生，发生地多为偏远、经济相对落后的地方，以受污染的糯米汤圆粉及吊浆面为主。引起食物中毒的食品，一般是在生产加工、贮存运输、销售等过程中被污染的。在污染的微生物中，致病性微生物一般数量相对较少，却有大量的非致病性微生物污染，两者之间比例悬殊。有时在分离过程中，食物样品分离不到病原菌，可能是被大量的非致病菌所掩盖。这不仅关系到流行病学调查中病因的查找和确定，也关系到合理的医疗处置和治疗。因此，必须根据实际情况，选择合适的增菌液和培养基，提高致病菌的检出率，同时在检验过程中，不能仅仅重视病原菌的检出，也要重视优势菌的检出［3］。2014年7月5日，云南省文山市广南县八宝镇某村发生一起食物中毒事件，中毒人数20人，死亡6人，中毒食物为汤圆。中毒者发病急，出现上腹部不适、恶心、呕吐、头痛、头晕、全身无力、意识不清、抽搐、昏迷等症状或体征，疑为椰酵假单胞菌食物中毒。本实验室采集中毒者进食食物样品4份，按照WS/T12—1996《椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒诊断标准及处理原则》［4］和GB/T4789.29—2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》［5］制定了快速检测方案，采用全自动微生物生化鉴定和基因指纹鉴定等快速检测技术，对样品开展椰酵假单胞菌的分离及米酵菌酸毒素检测。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品试验选取吊浆面、已煮过的汤圆、未煮汤圆、生吊浆粑各一份。

1.1.2实验动物健康昆明小白鼠12只，普通级，体质量20g左右［由昆明医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(滇)2011-0004］，饲料由昆明医学院实验动物中心提供，动物饲养环境条件:温度20～24℃，相对湿度46%～58%。

1.1.3主要仪器与试剂VITEK2COMPACT全自动微生物生化鉴定仪(法国梅里埃)、基因指纹鉴定仪(美国杜邦)、1290超高效液相色谱仪(美国Agilent)、生化培养箱。SS琼脂平板、卵黄琼脂平板、GVC增菌液均购自北京陆桥技术公司，PDA半固体琼脂、PDA平板均购自英国Oxoid［PDA平板分为2种:第一种为直接配制，不添加龙胆紫和氯霉素水溶液;第2种在PDA中添加龙胆紫(1∶100000，V/V)和氯霉素水溶液(终浓度为20μg/ml)］。

1.2方法

1.2.1分离鉴定方法按照GB/T4789.29—2003中规定的方法进行增菌、平板分纯，用VITEK2COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和基因指纹鉴定仪进行鉴定。

1.2.2小鼠毒性试验和米酵菌酸测定小鼠毒性试验按照GB/T4789.29—2003中规定的方法进行，每份样品采用小白鼠3只，每只取0.5ml粗毒素进行灌胃，7d内观察受试动物反应和死亡情况。米酵菌酸检测按照GB/T11675—2003《银耳卫生标准》［6］执行，采用液相色谱-质谱联用法对样品开展米酵菌酸毒素检测。

1.2.3仪器条件色谱条件:WatersBEHHILIC色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，流动相A为水(0.1%甲酸)、B为甲醇，流动相比率A∶B=3∶7，等梯度洗脱3min，流速300μl/min，进样量20μl，柱温30℃。质谱条件:离子化方式为电喷雾离子源(ESI)负离子模式，检测方式为多离子反应监测(MRM);碰撞气(CAD)Midium，气帘气(CUR)172.375kPa，雾化器(GS1)310.275kPa，加热气(GS2)379.225kPa，喷雾电压(IS)－4500V，去溶剂温度(TEM)400℃，扫描时间20ms，米酵菌酸保留时间0.60min。

2结果与分析

2.1分离鉴定结果4份样品中，3份样品(吊浆面、已煮过的汤圆、生吊浆粑)在PDA分离平板上有少量(每皿大约8～15个)可疑目标菌生长，培养24h后，平板上形成的菌落大小约1～1.5mm，呈灰白色、湿润、表面光滑、边缘整齐。培养48h后，中心有凸起，菌落周围有黄绿色色素，具有典型椰酵假单胞菌的菌落特征。挑取PDA平板上可疑单个菌落，点种卵黄琼脂平板及SS琼脂平板。在卵黄琼脂平板上，可见形成表面光滑及湿润的菌落。置36℃温箱内培养48h后，菌落周围形成乳白色混浊环，对日光斜视可见环表面呈明显虹彩现象;SS琼脂平板上无菌生长。取PDA斜面上的菌苔做相关生化试验，结果为动力+、氧化酶-、靛基质-、V-P(-)、O/F试验(O型)+、葡萄糖-、果糖-、半乳糖-、阿拉伯糖-、甘露醇+、硝酸盐还原+、尿素-、侧金盏花醇-、柠檬酸盐利用+、精氨酸+(+表示阳性结果，-表示阴性结果)，5和41℃温度下不生长。用VITEK2COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和基因指纹鉴定仪鉴定，3份样品结果均为唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderiagladioli)，因无相应血清所以未做血清学分型。除目标菌外，PDA平板上还有大量杂菌生长，杂菌是优势菌，杂菌经染色镜检和鉴定大多为酵母菌。1份样品［未煮汤圆(湿)］未分离出椰酵假单胞菌。

2.2动物急性毒性检测4份样品，每份样品采用3只小白鼠，每只小白鼠取0.5ml粗毒素灌胃，小鼠主要出现竖毛、躁动不安、步履蹒跚、肢体麻痹、抽搐、瘫软、呈角弓反张状、呼吸急促等症状或体征，在2h内全部死亡。

2.3米酵菌酸测定采用液相色谱-质谱联用法对样品开展米酵菌酸毒素检测，从送检4份样品中均检出了米酵菌酸。吊浆面米酵菌酸的含量为1.73mg/kg，已煮过的汤圆含量为3.08mg/kg;生吊浆粑含量为9.67mg/kg，含量为4份样品中最高的;未煮汤圆虽未分离到活菌，但仍检测到米酵菌酸，含量为5.07mg/kg。

3讨论

1977年在东北酵米面中毒食品中发现椰酵假单胞菌［7］。现已证明该菌主要产生2种毒素，即米酵菌酸和毒黄素，前者是引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物［2］。在食物中毒病原菌分离鉴定过程中，增菌与分离培养是关键环节。椰酵假单胞菌的GVC增菌液是添加了龙胆紫和氯霉素水溶液的马铃薯葡萄糖水(PD)，其原理是利用龙胆紫能抑制革兰阳性菌和氯霉素能抑制革兰阴性菌而不抑制椰酵假单胞菌的特性［8］。但在本次食物中毒实验室分析中，除了椰酵假单胞菌，其他革兰阳性菌及革兰阴性菌很少，优势菌是酵母菌，酵母菌属于真菌，而椰酵假单胞菌在微生物分类学上属细菌，但培养特性接近真菌［9］，这就解释了出现GVC增菌液中的龙胆紫和氯霉素没能抑制酵母菌，经过GVC增菌液增菌以后酵母菌大量繁殖，在PDA平板上杂菌的数量多，目标菌的数量少的现象。

本次试验中，利用VITEK2COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和基因指纹鉴定仪鉴定，其结果为唐菖蒲伯克霍尔德菌(B.galdioli)。Gillis等［10］将椰酵假单胞菌化归为伯克霍尔德菌属，命名为椰毒伯克霍尔德菌(B.cocovenenans)，Coenve等［11］将椰毒伯克霍尔德菌划为唐菖蒲伯克霍尔德菌。唐菖蒲伯克霍尔德菌是伯克霍尔德菌属中的一个种，它包含3个不同的致病型:B.gladiolipathovargladioli、B.gladiolipathovaralliicola、B.gladiolipathovaragaricicola。1999年焦振泉等研究发现，椰酵假单胞菌和唐菖蒲伯克霍尔德菌致病型菌株的典型株在生化特征上差异很小，在比较椰酵假单胞菌16SrRNA基因序列后，根据细菌的系统分类将其划归为唐菖蒲伯克霍尔德菌的一个病原型［12-13］，2003年JIAO等［14］建议将椰毒伯克霍尔德菌列为唐菖蒲伯克霍尔德菌的第4个致病型，即B．gladiolipathovarcocovenenans。2008年焦振泉等［15］建议划分椰酵假单胞菌米酵菌酸产毒株及不产毒株为唐菖蒲伯克霍尔德菌的生物变种(一个或几个)或新的生物型。2005年杜春明等［16］则通过对唐菖蒲伯克霍尔德菌中不同致病型菌株的菌体脂肪酸成分的测定和分析，发现它们的脂肪酸成分上基本一致，又进一步证实了原来的唐菖蒲伯克霍尔德菌、椰毒假单胞菌和椰毒假单胞菌酵米面亚种应该合并为一个菌种。以上的研究分析不同菌株基因水平的差别，并阐述其系统发育关系，说明椰酵假单胞菌和唐菖蒲伯克霍尔德菌致病型菌株的典型株在生化特征上差异很小，支持了椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德菌更为近缘这一结论。本研究中病原菌经全自动微生物生化鉴定仪和基因指纹鉴定仪鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌，试验结果跟上述研究报道一致，椰酵假单胞菌即唐菖蒲伯克霍尔德菌。

值得一提的是，4份样品中，3份样品［吊浆面、已煮过的汤圆、生吊浆粑(干)］分离出椰酵假单胞菌;未煮汤圆(湿)未分离出椰酵假单胞菌。出现生面未检出，已煮过的汤圆检出的情况可能原因是煮过的汤圆加热不彻底(夹开汤圆，面中间明显有生的部分)，而内部的椰酵假单胞菌未能被杀死，但酵母菌的总数量反而因加热减少了，对椰酵假单胞菌造成的抑制和影响作用有限，而放置了几天的未煮汤圆(湿)中酵母菌大量繁殖，掩盖和抑制了椰酵假单胞菌的生长和分离，出现已煮过的汤圆中分离到病原菌而在未煮的汤圆中反而未分离到病原菌的现象。细菌性食物中毒大多是由蛋白质毒素引起，而椰酵假单胞菌有别于其他菌的明显特点是产生脂肪酸性质的外毒素———米酵菌酸。米酵菌酸是由细菌产生的小分子毒素，其化学本质是多不饱和脂肪二酸衍生物［17］。采用液相色谱-质谱联用法从4份样品中均检测出米酵菌酸。结合小鼠毒性试验结果和菌落分离及鉴定结果可以认为本次食物中毒就是由椰酵假单胞菌引起的。

近年来，由椰酵假单胞菌产生的毒素所引起的食物中毒偶有发生，其致病力强，死亡率高，给消费者的健康带来很大危害。我国东北地区发生此种细菌食物中毒，多为食用发酵玉米面制品而引发的，山东、河南发生过变质鲜银耳中毒，此次云南食物中毒事件就是由于食用了被污染又未熟透的汤圆，说明中毒的发生与中毒者的饮食习惯以及食品加工方式有关。预防椰酵假单胞菌食物中毒的发生应注意:不用霉变的玉米、糯米等制备酵米面，浸泡米面时勤换水，保持卫生，储存放置地点要通风防潮。在食物的储存、加工等环节注意防止污染，以预防中毒的发生。

作者：李晓琍 杨祖顺 国译丹 周慧新 范璐 李瑛 单位：云南省疾病预防控制中心