帕金森病基因治疗研究范文

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《中国神经精神疾病杂志》2015年第十一期

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是一种以脑内多巴胺能神经元进行性丢失和路易小体形成为特征的神经退行性疾病，主要表现为运动迟缓、肌强直、震颤、姿势步态异常等运动障碍，亦常伴有嗅觉减退、睡眠障碍等多种非运动症状。目前临床上主要以药物治疗、康复训练、脑深部电刺激等对症治疗为主，尚没有控制疾病发展的有效手段。基因治疗技术通过将目的基因导入相关脑区影响特异性蛋白质表达，有可能延缓多巴胺能神经元的丢失或纠正神经递质失衡。近期有多项临床研究尝试通过立体定向手术导入靶基因，从保护多巴胺能神经元、提高多巴胺递质、拮抗抑制性神经递质等不同角度治疗PD[1-2]。本文就相关研究进展进行综述。

1神经营养因子基因治疗策略

在PD的病程中，多巴胺能神经元的变性坏死是逐渐发生的，故在疾病发展过程中保护残存的多巴胺能神经元、防止其继续死亡有望阻断PD进展。研究表明[3]，转化生长因子α（transforminggrowthfactor-α，TGF-α）、血小板源性生长因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）、脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）、神经营养因子（neurturin，NTN）及胶质源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrphicfactor，GDNF)均对多巴胺神经元有营养保护作用。这些措施在各种帕金森病动物模型上均被证实可提高多巴胺能神经元的存活率，阻止神经元进一步变性，从而改善运动症状。其中以GDNF和NTN研究最多，且均进入临床研究阶段。

GDNF为转化生长因子-β超家族成员之一，但与转化生长因子-β超家族中其他成员不同，GDNF是通过激活酪氨酸激酶Ret来激活细胞内下游的信号通路[4]。并且GDNF对多巴胺能神经元具有神经保护和修复作用，能促进多巴胺能神经元的存活及其形态分化，并增加外源性多巴胺吸收的亲和性。有研究发现，将慢病毒介导的GDNF基因导入MPTP诱导的PD猴模型的纹状体和黑质中，结果发现TH免疫阳性神经元增加7倍，表明GDNF能够调节中脑腹侧多巴胺神经元的存活及表型，并能使黑质神经元向多巴胺神经元转化从而弥补局部神经元的缺失[5]。然而GDNF的长期应用可能会同时影响到正常的神经元的功能：研究显示，GDNF在纹状体的长期过表达可下调正常黑质纹状体系统多巴胺神经元的TH表达水平，黑质致密部THmRNA的表达降著减少[6]。在I/II期临床试验中，显示出了部分疗效：入选的34例PD患者中，GDNF组患者双侧壳核输注重组人GDNF，治疗6个月后GDNF组和对照组UPDRS运动评分改善分别平均为10%和4.5%；PET示GDNF组患者背侧壳核18F-左旋多巴吸收值增加23.1%，而对照组无明显变化[7]；但是，GDNF组患者全都出现了不良事件，主要表现为感觉异常、头痛、上呼吸道感染、运动障碍等，而对照组患者全部出现以运动障碍为主的不良事件。研究者认为这可能与GDNF剂量过高或其扩散吸收需要较长的时间有关，将来的研究可通过设计细胞或病毒载体的表达系统，调控GDNF稳定长期表达。NTN与GDNF有相同的结构和功能特性，在体内能通过激活GDNF家族受体而促进多巴胺能神经元的存活[8]。

在MPTP诱导的PD猴模型的实验中，立体定向注射2型腺相关病毒介导的NTN（AAV2-NTN），治疗后4个月发现存活的黑质神经元增加及运动损害改善，并且治疗后NTN持续表达长达12个月。随后进行了I期临床试验，入选的12例PD患者经立体定向手术在双侧壳核内注射不同剂量AAV2-NTN[9]。患者部分运动功能得到改善，不服药时UPDRS运动评分平均改善14分，PET示治疗后18F-左旋多巴吸收无变化，手术操作耐受良好，1年后均无严重不良事件发生。接着进行了II期临床试验，38例患者为治疗组，通过头颅立体定向技术向双侧壳核内缓慢微量输注共80uLAAV2-NTN（5.4×1011单位），20例患者进入假手术对照组，仅接受头颅钻孔定位（不穿透颅骨内表面）而不给予任何液体[10]；治疗后12个月“不服药时UPDRS评分”组间无显著差异，PET扫描示18F-左旋多巴吸收值组间亦无显著差异，但在治疗后18个月，治疗组患者UPDRS评分的降低显著优于对照组，提示NTN基因治疗起效缓慢，可能需更长的随访期才能体现出疗效差异。实验组有13例出现了严重不良事件,对照组有4名出现严重不良事件,研究者分析可能与手术操作相关。初步研究显示，NTN基因治疗可能有助于改善帕金森病患者运动症状，但其起效缓慢，且安全性还需进行多中心临床试验进一步评估。

2酶替代基因治疗策略

多巴胺是由酪氨酸在多种酶的协同催化作用下，经过复杂的生化反应最终生成的。其中，有3种酶对多巴胺的高效合成最为重要：酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase，TH）在黑质纹状体将L-酪氨酸转变成左旋多巴，随之经芳香族氨基酸脱羧酶（aromaticL-aminoaciddecarboxylase，AADC）转变多巴胺；GTP-环化水解酶1（GTPcyclohydro⁃lase-1，GCH1）是合成TH辅助因子——四氢生物蝶呤的限速酶[11]。帕金森病患者黑质多巴胺能神经元进行性变性，导致多巴胺显著性下降，而通过长期口服左旋多巴来增加多巴胺含量会产生一系列严重的运动并发症[2]。酶替代基因治疗是通过在纹状体表达多巴胺合成的关键酶来提高多巴胺含量，从而改善临床症状，并减少口服药物剂量。

2.1AADC基因治疗有研究表明，表达AADC的细胞在进展期PD患者服用左旋多巴的治疗中起重要作用，能显著提高外源左旋多巴的脱羧效率，使其更高效地转换为多巴胺，从而降低左旋多巴需求量及其不良反应[12]。在此基础上研究者开展了一系列AADC基因治疗PD的尝试：在AADC基因联合c17.2神经干细胞移植入大鼠纹状体内的实验中，实验组大鼠行为学明显改善，且纹状体TH阳性细胞明显增多[13]；在MPTP诱导的猴PD模型中单侧纹状体输注腺相关病毒介导的AADC（AAV-AADC），FMT-PET扫描示尾状核AADC表达信号随着时间延长而增加；行为学表现得到一定改善，但部分出现不良反应，如肢体活动过度、刻板动作、幻觉、注意力分散；长期随访研究证实治疗效应持续8年，并且没有其他严重不良事件出现[14]。随后开展了I期临床试验，在中重度PD患者双侧壳核内输注AAV-AADC，且使用2个不同剂量组（9×1010和3×1011单位），UPDRS总评分及运动评分得到一定改善，FMT-PET扫描信号显示AADC表达增加，分别为30%（低剂量组）、75%（高剂量组）[15]。但有3例患者出现颅内出血，可能与神经外科手术操作有关；有4例患者随后（基因治疗10~15个月后）需进一步行DBS治疗[16-17]。目前研究表明，AAV-AADC基因治疗可能有效，相关不良事件很可能与基因载体输注的手术方法有关。正进行的I/II期临床试验有助于进一步评估AAV-AADC的疗效及安全性。

2.2GCH1和TH基因治疗除了AADC，帕金森病患者纹状体内TH、BH4与GCH1的表达也低于正常，通过提高纹状体局部GCH1的表达，可弥补BH4的耗损，同时可稳定TH的表达并增强其活力。与AADC相比，联合GCH1和TH是一种组合酶基因治疗策略。研究显示，在大鼠PD模型单侧纹状体输注AAV-TH-GCH1共表达基因，治疗4周后大鼠运动功能改善，且改善程度与纹状体内多巴胺恢复水平相关；免疫组化染色示纹状体和部分皮质区域出现大量转入基因表达但同时伴有苍白球神经元的丢失[18]。随后研究者在大鼠PD模型植入可稳定调控多巴胺生成的基因表达系统，通过偶联二氢叶酸还原酶（dihydrofolate，DD）形成重组DD-GCH1基因组，给予甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，TMP）调控多巴胺的生成[19]。结果显示给TMP后，AAV-TH-DD-GCH1组大鼠行为学显著改善并持续到33周，生成多巴胺含量较对照组高且稳定，其疗效与TMP给药剂量和时间相关。目前相关研究尚未进入临床研究阶段。

2.3AADC，GCH1，TH基因联合治疗通过构建慢病毒载体（Lentiviral）同时转导AADC、GCH1、TH这三种多巴胺合成的关键酶基因来增加多巴胺的合成，这一方案能够明显改善PD大鼠的运动功能[20]。进一步研究发现，在MPTP诱导猴PD模型注射这种病毒载体12个月后，运动功能改善，并且没有引起其他运动障碍[21]。随后研究者开展了I/II期临床试验，设计三种不同剂量的联合基因治疗组（Lenti-AADC-TH-GCH1），通过立体定位技术在PD患者双侧纹状体输注Lenti-AADC-TH-GCH1[22]。随访结果显示：UPDRS运动评分(不服药时)较基线明显减少；无严重不良事件发生；仅有2例患者随后接受了脑深部电刺激术。4年随访数据初步证明这一基因联合治疗方案的安全性及有效性，具有较好的发展前景。

3GAD基因治疗策略

PD黑质神经元的退变导致纹状体多巴胺的显著耗竭，主要抑制性传出神经核团——黑质网状部及苍白球内侧部在过度激活的丘脑底核(subthalamicnucleus，STN）核团的驱动下传出过多的抑制性冲动，从而引起以运动障碍为主的PD症状——静止性震颤、肌强直、运动迟缓和步态紊乱[23]。STN局部高频刺激（deepbrainstimulation，DBS）是进展期PD治疗的有效手段，其通过阻断STN神经元的活性而降低STN神经元传出的抑制性神经冲动，同时提高黑质网状部局部神经递质Υ-氨基丁酸（GABA）的浓度[24]。因此，应用基因治疗提高STN及其终末区局部GABA神经递质的浓度可改善PD的临床症状。GABA为脑内主要的抑制性神经递质，可由谷氨酸脱羧酶的两种异构体GAD65和GAD67产生，将GAD65基因转入大鼠STN，可显著改善PD大鼠模型的症状，而局部转染GAD67基因却无这一效果[25]。用AAV-GAD65处理6-OHDA诱导的PD小鼠，电生理记录发现GABA释放增加；随之刺激STN，运动功能得到改善。接着进行AAV-GAD治疗MPTP诱导的PD猴的研究，发现帕金森病临床指标显著改善，并且疗效超过56周，注射部位FDG-PET活性相应明显增加[26]。该研究结果初步显示GAD基因治疗安全，且无不良事件发生。在随后的I期临床试验中，入选12例PD患者，单侧丘脑底核经立体定向技术注射AAV-GAD65,治疗后12个月UPDRS运动评分显著改善，同侧FDG-PET吸收增加，同侧丘脑的代谢活性明显减弱[27]，在围手术期内未出现与治疗有关的不良事件。研究者又开展了II期临床试验，治疗组随机分配22例患者（接受双侧丘脑底核注射AAV2-GAD），假手术组23名患者，治疗后6个月，治疗组UPDRS评分结果较对照组略有改善但差异无统计学意义(P=0.19)，无严重不良事件发生，术后MRI未显示丘脑底核损害，副作用相对轻微，包括头痛和恶心[28]。AAV2-GAD的临床试验研究表明该方法相对安全，还需进行更多的研究来比较这些结果疗效与传统DBS治疗的疗效。

4基因治疗选用的载体

目前，病毒载体可以将外源基因成功带入PD动物模型的中枢神经系统，对维持携带基因的表达有特定的优势(通过形成游离基因或整合到宿主基因)。现阶段应用于临床试验的主要为AAV和慢病毒载体。AAV是一种辅助依赖型的细小病毒，由4.7kb的单链DNA和包裹的二十面蛋白衣壳组成，在递送基因时不影响正常基因的功能，可长期稳定表达外源基因[29]。AAV有多种亚型，迄今以血清型命名AAV亚型分为AAV1-AAV12，主要以人类和灵长类动物为宿主，其中AAV1-6是从人类组织中分离获得。尽管不同AAV血清型的病毒都具有二十面体结构，但其衣壳蛋白在序列与空间构象上具有多样性，使得其细胞结合受体以及细胞嗜性存在显著差异[30]。AAV2和AAV3的主要受体为硫酸肝素蛋白多糖；AAV4的受体为O-连接的唾液酸；AAV1、AAV5和AAV6的受体为N-连接的唾液酸；AAV8的受体为层黏连蛋白受体LamR；AAV9对心肌的亲和性较高[31]。目前用于PD研究的主要有AAV2、AAV8和AAV9，且AAV载体在末端重复序列之间最多可携带长4.5kb的外源基因[32]。慢病毒为一类逆转录病毒的总称，由慢病毒改建而来的载体系统以其高效而稳定的基因转移效率及低免疫原性成为近年来研究者们的常用选择[33]。慢病毒载体主要具有以下特点：既可以转染处于有丝分裂活跃期细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期细胞；由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗力；可兼容多个转录启动子；经过改建后的慢病毒载体可容纳约10kb的外源基因[34]。

5基因治疗手术方式

目前向PD患者脑内输注携带目的基因的载体均通过立体定向技术实现，病毒载体将目的基因整合入靶细胞基因组，并调节其稳定表达。注射靶区主要为与帕金森病病理改变密切相关的部位，不同研究依携带基因的不同而选择不同的注射部位：纹状体（Lenti-AADC-TH-GCH1），术后患者出现头痛、脑水肿、硬膜下血肿（进针手术部位）等[22]；壳核（AAV2-NTN、AAV-AADC），患者出现与手术操作相关的并发症如惊厥、脑水肿、出血、短暂精神改变、尿潴留等[10]；丘脑底核（AAV2-GAD），术后患者出现头痛、恶心等[28]。这些临床研究均未出现与基因治疗药物相关的不良事件，其并发症主要与手术操作相关，改进手术方法及增强术后护理有可能减少相关并发症的发生。

6展望

多项临床前期实验、小规模I期和II期临床研究显示，基因治疗对缓解PD症状、改善PD运动功能有较好的疗效，并且未出现与目的基因、病毒载体相关的并发症，很可能成为PD治疗的新方法，特别以慢病毒介导的AADC、GCH1、TH联合基因治疗方案展现出较好地转化前景。在此基础上，选择合适的病毒载体携带不同基因精确地植入相关脑区，并探索植入基因长期表达的调控策略，如：探索调控药物的剂量与时间窗关系，从而使目的基因能以生理方式稳定表达，提高基因治疗的效果，阻止PD的病理进展。不同治疗策略之间优缺点的比较尚有待进一步研究，同时需完善手术方式，减少与手术操作相关的并发症，改善患者生活质量。

作者：蔡琼 靳令经 单位：同济大学附属同济医院神经内科