降植烷诱导小鼠类风湿关节炎模型范文

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《中国免疫学杂志》2015年第十一期

类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一种以进行性、侵蚀性关节破坏为特征性病理改变的全身性自身免疫病。其基本病理改变主要是滑膜慢性炎症及关节软骨和骨质的破坏，临床特征为关节结构的炎症和肿胀、慢性进行性病程，并可致多个关节完全强直，最终导致功能的丧失，致残率高［1］。因此，为临床发病机制的研究及寻找新的诊疗手段，建立一种能准确模拟RA发病过程的动物模型尤为重要。目前，最为常用的RA模型为Ⅱ型胶原诱导的小鼠或大鼠模型，但其建模过程需要通过尾静脉注射Ⅱ型胶原和佐剂的混合物，操作难度大［2］。降植烷是一种常用的致炎剂，有文献报道其能不依赖于T或B细胞激活免疫系统引起免疫反应［3，4］。本文以BALB/c小鼠为研究对象，拟制备降植烷诱导的RA小鼠模型并对其免疫病理变化进行评价。

1材料与方法

1.1实验动物及分组6～8周雌性BALB/c小鼠30只，体质量25～30g，由苏州大学实验动物中心提供。采用随机数字表法分为模型组及对照组，每组15只。SPF级动物房常规饲养。实验方案得到苏州大学附属第一医院动物伦理委员会批准。

1.2主要试剂降植烷，即2，6，10，14-四甲基十五烷，购于美国Sigma公司。PE标记抗小鼠抗体CD11b、CD11c、Gr1，FITC标记CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC标记抗小鼠抗体B220均购置美国eBioscience公司。

1.3降植烷诱导RA小鼠模型的制备小鼠适应性饲养1周，造模组于0周、9周、18周时腹腔各注射0.5ml降植烷;对照组于相同时间腹腔注射0.5ml生理盐水。第21周时，采用颈椎脱臼法处死小鼠，保留小鼠脾脏及双侧后肢关节，分别行免疫学及组织病理学检测。

1.4小鼠足趾厚度的测定从第18周起，使用游标卡尺对小鼠同侧的后足跗跖关节肉厚处进行测量，每周测量2次，每次重复测量3次，取平均值。所有测量由两名实验者独立完成。

1.5关节炎指数评分(Arthritisindex，AI)从第18周起，对各组小鼠关节肿胀程度进行评分，每周评测2次，每次重复测量3次，取平均值。采用关节炎评分法(0～4分)［5］，0分:无关节炎;1分:有红色斑点或轻度肿胀;2分:关节部位中度肿胀;3分:严重肿胀;4分:严重肿胀且不能负重，四肢评分的和即为关节炎指数(最大分数16)。

1.6流式细胞检测脾细胞免疫分子表达变化取小鼠脾脏制成单细胞悬液，5×105个细胞加入各流式分析管，分别加入PE标记抗小鼠抗体CD11b、CD11c、Gr1，FITC标记CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC标记抗小鼠抗体B2204℃避光孵育1h，经洗涤，1%多聚甲醛固定，流式细胞仪分析细胞的免疫分子在脾脏细胞中的表达情况。

1.7组织学观察小鼠处死后切取后肢膝关节，剔除皮毛和肌肉浸泡于4%甲醛溶液固定3d，而后放入10%EDTA液中脱钙30d，常规石蜡包埋，4μm切片，H＆E染色，普通光镜观察。1.8统计学处理所有实验数据以x±s表示，SPSS16.0统计软件处理数据。采用t检验进行统计学分析，分析前所有数据均进行方差齐性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1小鼠一般情况造模期间，小鼠无死亡。正常组小鼠精神状态好，能正常爬行，关节活动自如，无红肿;第三次注射免疫(18周)后，造模组有11只小鼠出现症状(成模率73.3%)，具体表现为足爪红肿，体型消瘦，毛色杂乱稀疏，步态异常，倦怠易激惹;足部存在不同程度肿胀，关节增粗，黏膜红肿渗出。见图1。小鼠足掌厚度测量结果显示，21周时模型组小鼠后足肿胀最为明显，厚度为(2.90±0.51)mm，与对照组(1.29±0.47)mm比较，差异有统计学意义(t=－6.097;P＜0.05);关节炎评分结果显示21周时11只成模小鼠中，有4只症状较轻，7只发病严重，关节炎指数为9.55±2.80。

2.2组织病理学观察正常小鼠膝关节结构完整无损，无骨小梁吸收，关节软骨光滑平整(图2A)。模型组小鼠膝关节结构被破坏，有骨小梁吸收，关节软骨可见坏死脱落，纤维化，关节腔狭窄。炎细胞大量浸润，伴有程度不同的软组织水肿。

2.3小鼠脾细胞流式细胞检测结果21周时取脾脏制成单细胞悬液，荧光抗体标记后经流式细胞仪检测，结果显示，模型组脾脏细胞中CD11b、CD11c和GR1表达明显增加，提示吞噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞亚群数量增加(表1，P＜0.05)。模型组中T细胞表面的表面标志CD4、CD8、CD154均有不同程度的增高，与对照组比较差异有统计学意义(表2，P＜0.05)。模型组和对照组脾脏细胞中B220及CD21、CD23、CD80、CD86的表达未有明显差异(P＞0.05，结果未列出)。

3讨论

类风湿性关节炎是一种累及全身关节的自身免疫性疾病，其病理特征是慢性炎细胞浸润和滑膜增生，最终导致关节软骨和骨质破坏［1］。迄今为止，RA发生的确切机制尚不清楚，还没有有效的预防和治疗方法，所以，建立一种能够准确模拟人类RA发病过程的动物模型对研究RA病因及药物治疗至关重要。降植烷，即2，6，10，14-四甲基十五烷，是叶绿素分解后的产物。有学者发现降植烷能促进小鼠B淋巴细胞瘤的发生，而将降植烷经腹腔注射后能诱导产生狼疮特异性抗体，实验小鼠表现出明显的系统性红斑狼疮的特征。在本研究中，笔者将0.5ml降植烷经腹腔注射给BALB/c小鼠，并在9周和18周时各补注1次，21周时实验小鼠表现出明显的关节炎症状，发病率为73.7%，与Potter等［10］报道一致。组织学染色发现，实验小鼠关节滑膜增生明显，有大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和单核细胞为主，软骨和骨组织破坏明显，有血管翳形成，与人类RA患者病变关节组织病理改变类似。汪婷婷等［4］在降植烷诱导的大鼠关节炎模型中也发现了类似的病理改变。上述结果提示经腹腔注射降植烷能够诱导小鼠产生关节炎病理改变。

有研究表明，T细胞尤其是CD4+T细胞在RA发病过程中起重要作用。在RA滑膜浸润的单核细胞中，30%～50%为T细胞，而且这些细胞多处于活化状态，并且通过与巨噬细胞相互作用，引起软骨和骨组织破坏。笔者研究发现，降植烷免疫后的小鼠脾脏中CD4、CD8和CD154+T细胞数量明显增多，提示降植烷可能通过调节T细胞引起小鼠关节炎病理改变。Holmberg等的研究表明降植烷是一种非免疫原性的佐剂，不能被T细胞或B细胞特异性识别，降植烷致关节炎的能力也就取决于其对免疫系统的非特异性刺激引起的自身反应性T淋巴细胞活化，引起关节急性炎症，随后进入慢性进展和反复发作阶段。因此，在免疫学特征方面，降植烷诱导的RA模型可能更类似于RA患者，更适于RA病理机制的研究。B细胞在RA关节滑膜中的数量较少，但近年来的研究发现B细胞在RA发病机制中起重要作用。

Takemura等证实RA滑膜中T细胞的激活和作用是B细胞依赖性的;B细胞作为一种抗原递呈细胞，向T细胞提供共刺激信号;B细胞还能通过分泌TNF-α等炎症因子、趋化因子以及类风湿因子等进一步加重RA关节破坏［16，17］。我们的结果显示在降植烷诱导小鼠狼疮性肾炎的起始阶段可引起B细胞功能活化，但是，在本研究中流式细胞检测结果表明，降植烷免疫后的小鼠脾脏内B细胞表面标志CD21、CD23、CD80、CD86的表达未有明显差异，我们推测B细胞功能在降植烷引起的后期免疫反应趋于稳定。综上所述，经腹腔注射降植烷能够成功诱导小鼠关节炎，并产生与RA患者类似的免疫学改变，是一种可靠的RA动物模型，为探讨RA的发病机制及寻找RA的诊疗的新技术新方法提供研究工具和物质基础。

作者：陶云霞 蔡磊 沈辉 朱玉强 邱玉华 顾巧丽 耿德春 施勤 单位：苏州大学附属第一医院骨科