壁虎醇提物抑制C6的增殖范文

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《中国临床药理学杂志》2015年第二十二期

神经胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，发生于神经外胚层，具有发病率高、治愈率低、复发率高及病死率高等特点，药物、放射和手术等组成的综合治疗方案是目前的主要治疗方法。常规的化疗药具有严重的不良反应，并且易有耐药现象的发生，导致其疗效和应用受到了限制［1］。本实验研究壁虎醇提物(Gekkoethanolextract，GEE)对C6细胞的抗肿瘤活性，并对GEE抗肿瘤的机制进行初步探索。

一、材料与方法

1材料

细胞胶质瘤C6细胞株，由中国药科大学惠赠。药品与试剂多疣壁虎，批号:090301，安徽永刚饮片公司生产;5－氟尿嘧啶，批号:FA131008，规格:每支10mL/0.25g，上海海普药业生产生产。DMEM干粉，美国Gibco公司生产;胰酶、四甲基偶氮唑盐及Hoechst33258，均美国Sigma公司生产;PVDF膜，美国PALL公司生产;AIF一抗，北京博奥森公司生产;β－actin、caspase－9一抗，北京中杉金桥公司生产。仪器SK3c细胞培养箱，日本Sanyo公司产品;JM－L研磨机，上海诺尼轻工机械有限公司产品;BX41荧光显微镜，日本Olympus公司产品;Minitrans－blot电转膜系统，美国Bio－Rad公司产品。

2实验方法

2.1细胞培养用含10%胎牛血清的培养液在37℃、5%CO2条件下培养，以0.25%胰蛋白酶消化、传代，并进行实验。

2.2GEE的制备双蒸水400mL与壁虎干粉100g混匀后，研磨4h，离心取沉淀。用55%乙醇溶液醇沉4h后，离心，取上清，进行旋转蒸发去除乙醇，冻干得GEE干粉，贮于－20℃冰箱备用。

2.3MTT法检测GEE抑制c6细胞生长实验将C6细胞(5×104mL－1)200μL接种到96孔板，设5个复孔。培养24h后，实验组加入浓度分别为0.1，0.15，0.2，0.3，0.4mg•mL－1GEE的培养液，并设对照组(0.01mg•mL－15－氟尿嘧啶)和空白组，分别处理20，44，68h后，每孔加MTT溶液20μL。继续培养4h后，每孔加DMSO200μL，振荡混匀后，测定光密度(A490)值，计算抑制率。

2.4观察细胞形态改变以5×104mL－1的细胞浓度接种6孔板，培养24h后给药。设置空白组、对照组(0.01mg•mL－15－氟尿嘧啶)和实验组(0.1，0.2，0.4，0.6mg•mL－1GEE)，作用24h后，在倒置显微镜下观察C6细胞形态的改变。

2.5Hoechst33258荧光染色取C6细胞2mL，接种于铺有盖玻片的6孔板内，细胞贴壁后，分组给药(同2.4)，继续培养24h后，用4%多聚甲醛37℃固定10min，置于Hoechst33258染色液中，避光孵育10min。PBS冲洗后，取出盖玻片，观察并拍照。

2.6Westernblot法检测caspase－9与AIF蛋白的表达将C6细胞接种于6孔板中，分别设置空白组、实验组和对照组。空白组不加药，实验组分别加0.1，0.2，0.3mg•mL－1GEE培养液，对照组给予0.01mg•mL－15－氟尿嘧啶培养液，继续培养48h后提蛋白，进行变性PAGE电泳。AIF(1∶500)、caspase－9(1∶500)及β－actin(1∶1000)在4℃孵育过夜，羊抗鼠二抗(1∶1000)室温下震荡孵育1h，DAB显色后观察并分析结果。

3统计学处理结果数据以x珋±s表示，采用SPSS16.0进行统计处理，用单因素方差分析进行样本均数的比较。

二、结果

1GEE对C6细胞增殖的抑制作用药物作用于细胞24，48，72h后，GEE对C6细胞增殖有抑制作用，可见随时间的延长和药物浓度的增加，细胞抑制作用逐渐增强，呈剂量和时间依赖性。实验组与空白组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2细胞形态改变的观察及其改变倒置显微镜下观察，空白组，细胞大小均一，呈梭形，相互连接成网状。实验组，突起减少，细胞变圆，贴壁的细胞数量明显减少，细胞的胞浆可见空泡变性，胞质内的颗粒增多，形成大量的细胞碎片。荧光显微镜下观察，空白组，细胞核形态较好，呈椭圆形或圆形，可见均匀的蓝色荧光。对照组和实验组，细胞可见典型的凋亡形态学改变，表现为胞核缩小，大小不一，形态不规则，并有致密的强荧光团块，见图1。

3GEE对C6细胞caspase－9、AIF蛋白表达的影响不同浓度的GEE可诱导caspase－9、AIF蛋白的表达，且有不同程度的升高，与空白组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)，见图2。

三、讨论

前文研究发现，壁虎醇提物可以抑制移植于鼠肾包膜下的H22肝癌瘤块的生长，并且在体外可诱导人喉癌Hep2细胞凋亡。本实验研究发现，GEE能够抑制C6细胞的增殖及诱导细胞凋亡。本研究表明，caspase－9和AIF蛋白的表达量与GEE的药物浓度呈正相关，提示GEE可能通过增加caspase－9和AIF蛋白的表达水平，进而促进C6细胞的凋亡。GEE对C6细胞的增殖有明显的抑制作用，并诱导C6细胞凋亡，其机制可能与caspase－9和AIF蛋白表达水平上调相关。但GEE成分比较复杂，有待进一步研究。

作者：葛文静 王建刚 靳颖 李瑞芳 段冷昕 刘玲 单位：河南科技大学 医学院 药理学与分子生物学实验室