单糖组成测定影响因素范文

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《中国海洋药物杂志》2016年第二期

摘要：

目的研究不同因素对三斑海马多糖（HTP）降解的影响，探求适合其单糖组成测定的降解条件。方法通过设计正交实验，采用三氟乙酸（TFA）对HTP进行降解，结合1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色谱进行单糖组成分析，比较各实验的降解情况。结果HTP中主要含有Man、GlcN、Gal和少量的GalN、Glc、GlcA、Ara、Fuc共8种单糖。在考察条件范围内，温度和时间是影响单糖组成分析的主要因素，酸浓度是次要因素。HTP中各单糖的最适降解条件是：氨基糖GlcN和GalN为120℃，6h，4mol／LTFA；中性糖Man、Glc和Gal为110℃，4h，3mol／LTFA；糖醛酸GlcA及Ara、Fuc为100℃，2h，3mol／LTFA。通过对10种单糖标准品的降解也发现氨基糖（GlcN和GalN）较稳定，糖醛酸（GlcA和GalA）稳定性差。结论HTP中不同结构类型的单糖对降解条件的敏感度不同：糖醛酸易降解释放，但也易被破坏；氨基糖较难降解，但降解后较为稳定；中性糖的降解难易和稳定性介于两者之间。采用同一条件降解不能准确地测定HTP的单糖组成，需要针对不同结构类型单糖的性质采用不同的条件进行降解。

关键词：

三斑海马；多糖；单糖组成；柱前衍生；降解条件

海马作为中国名贵的海洋中药材，具有温肾壮阳，散结消肿等功效，常用于阳痿、遗尿、跌扑损伤、瘕瘕积聚、肾虚作喘及外治痈肿疔疮等［1］。在中国，海马具有悠久的药用历史，《本草纲目》中记载：“海马，主难产及血气痛；暖水脏，壮阳道；消瘾块，治疗肿毒”［2］。现代药理学研究表明，海马中含有丰富的蛋白质、氨基酸、多种脂肪酸、甾醇类化合物、磷脂和微量元素等成分，使其不仅具有激素样作用和增强造血功能，还在抗肿瘤、抗衰老和抗疲劳等方面发挥了重要作用［3－5］。根据文献记载，现全世界已知海马有近45种，产于中国沿海的至少有13种［6］。其中三斑海马是最为常见的1种，主要分布在广东、福建和海南沿海地区［7］。三斑海马，俗名龙落子，是刺鱼目海马属海洋生物，因头与躯干成直角，形似马头，体侧背方第1、4、7节各具一大黑斑，故得名。海马多糖作为海马体内1种重要的组成成分，鲜见其报道；因其单糖组成相对复杂，同时含有不同结构类型的氨基糖、中性糖和糖醛酸，很难采用单一条件对其单糖组成进行准确定量分析，这也为海马多糖的深入研究造成了困难。本实验首次通过正交实验设计，对三斑海马多糖的单糖组成测定的影响因素进行了较为系统的研究，以期探索适合其复杂单糖组成测定的降解条件。

1材料、试剂与仪器

三斑海马多糖（HTP），本实验室提取；三氟乙酸（TFA），上海展云化工有限公司；1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP），甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、氨基半乳糖（GalN）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Glc）、氨基葡萄糖（GlcN）、岩藻糖（Fuc）及半乳糖（Gal）10种单糖标准品，美国Sigma－Aldrich公司；甲醇，天津科密欧化学试剂有限公司；ZorbaxBondysilPC－C18色谱柱（4．6mm×150mm，5μm），中冉科技发展有限公司。1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；PH070型干燥箱，上海益恒实验仪器有限公司；MTN－2800D氮吹浓缩装置，天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

2实验方法

2．1HTP降解的正交实验选取降解温度（A）、时间（B）和TFA浓度（C）3个因素，分别在A为100、110和120℃，B为2、4和6h，C为2、3和4mol／L3个水平下按L9（33）正交表进行实验组合。准确称取HTP5mg，置于5mL安瓿瓶中，加入1mL相应浓度的TFA，封口后按照相应的条件进行降解［8－10］，降解完毕，使用氮吹仪除去TFA。

2．2降解液的柱前衍生化将各降解液用氮气吹干后，用1mL蒸馏水溶解，取100μL溶液（10mg／mL），加入100μLNaOH溶液（0．3mol／L），再加入120μLPMP（0．5mol／L）甲醇溶液，漩涡震荡混合均匀，置于70℃水浴中衍生1h。衍生完毕，加110μL盐酸溶液（0．3mol•L－1）中和后，加入500μL氯仿充分震荡，离心，除去有机相，反复萃取3遍，取上清液过0．22μm微孔滤膜，待用［11］。

2．3高效液相色谱（HPLC）分析对PMP衍生后的降解液采用HPLC分析，比较各色谱峰的峰面积变化情况，确定适合单糖组成测定的降解条件。色谱条件为：ZorbaxBondys－ilPC－C18色谱柱（4．6mm×150mm，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（pH＝6．7）／乙腈（82∶18，体积分数）；流速：1．0mL／min；柱温：30℃；进样：20μL；检测器：紫外检测器（VWD）；检测波长：245nm［12］。2．4单糖标准品的对照分析选取10种不同结构类型的单糖标准品，经等摩尔质量混合后，采用2mol／LTFA在110℃下分别降解2、4和6h，通过PMP柱前衍生HPLC法考察单糖的含量变化情况。

3实验结果和讨论

3．1HTP的单糖组成定性分析采用文献报道中单糖组成测定最常用的降解条件，即采用2mol／LTFA在110℃降解4h后［13－14］，采用PMP柱前衍生HPLC法进行单糖组成分析。经与10种单糖对照品的保留时间进行对比（见图1），发现HTP中的单糖组成较为复杂，主要含有Man、GlcN、Gal和少量的GalN、Glc、GlcA、Ara、Fuc共8种单糖。

3．2降解因素对HTP单糖组成测定的影响为了考察不同降解因素对HTP单糖组成测定结果的影响，本研究选取了降解温度（A）、降解时间（B）和TFA浓度（C）3个因素，以国内外多糖结构研究文献报道中最常用的单糖组成测定降解条件，即以2mol／LTFA在110℃降解4h为参考，分别在A为100、110和120℃，B为2、4和6h，C为2、3和4mol／L3个水平下采用L9（33）正交实验设计进行了考察。8种单糖的峰面积变化情况见表1。对表2的实验结果采用方差法进行分析，结果表明各因素对GalN降解率的影响程度依次为：温度（A）＞时间（B）＞TFA浓度（C），温度和时间是影响单糖组成分析的主要因素，TFA浓度是次要因素；其最适降解条件为：A3B3C3，即降解温度为120℃，降解时间为6h，TFA浓度为4mol•L－1。采用与GalN相同的分析方法对正交实验结果进行分析和综合比较，得出HTP中不同结构类型单糖组成测定的最适降解条件为：1）对氨基糖（GlcN和GalN）测定时，最适降解条件为120℃，6h，4mol／LTFA；2）对中性糖（Man、Glc和Gal）测定时，最适降解条件为110℃，4h，3mol／LTFA；3）对糖醛酸GlcA及Ara、Fuc测定时，最适降解条件为100℃，2h，3mol／LTFA。由此可见，不同结构类型的单糖对降解条件的敏感程度不尽相同。其中，氨基糖（GlcN和GalN）难被降解，对降解条件要求较高，而糖醛酸GlcA和Ara、Fuc较易降解释放，对降解条件的要求较低。常见的中性糖Man、Glc和Gal对降解条件的要求介于两者之间，即采用目前文献报道最常用的降解方法可以使它们很好地被降解和释放。因此，为准确测定HTP的单糖组成，需根据不同结构类型单糖最适的降解条件，分别进行降解和定量分析。

3．3单糖标准品的对照分析结果为了探究不同结构类型的单糖在降解条件下的稳定性，文中进一步选用了10种常见的单糖标准品进行了对照降解和分析考察。10种常见的单糖标准品采用文献中最常用的2mol／LTFA在110℃降解2、4和6h，其实验结果如表3。从表3可以看出，10种单糖标准品在降解过程中均有不同程度的损失，并且随降解时间的增加，其损失率也随之升高。从各单糖的降解损失率可以看出，氨基糖（GlcN和GalN）在选用的降解条件下较为稳定，损失率较低（在降解6h后损失率约为20％）；糖醛酸（GlcA和GalA）稳定性较差，易被破坏，损失率较高（在降解6h后损失率均高达50％以上）；其它中性糖（Man、Glc和Gal）的损失率（在降解6h后损失率约为30％～35％）略高于氨基糖，但较糖醛酸稳定，这与HTP的单糖组成测定影响因素考察结果较为吻合。但从HTP单糖组成测定的影响因素考察和10种单糖标准品的对照分析实验结果可以看出，多糖中单糖降解释放的难易程度和游离单糖的稳定性不存在直接必然的联系，并非完全是越容易被降解释放的单糖，其在降解条件下的稳定性就越差。例如，Fuc在HTP中较易被降解释放，但在选用的降解条件下却较为稳定（在降解6h后损失率为23．9％，接近于氨基糖），这可能与Fuc在海马多糖中的糖苷键连接方式相关。GlcA虽然在HTP中较易被降解释放，然而在硫酸软骨素中的GlcA可与N－乙酰基半乳糖形成耐酸降解的二糖单元，不容易被完全释放［15］，但GlcA一旦被释放出来，就容易被破坏（见表3）。另外有文献报道，麦芽糖（Glcα（1→4）Glc）和异麦芽糖（Glcα（1→6）Glc）虽然都是α－构型的二糖，但因两者的糖苷键连接方式不同，其相对水解速率分别为100和31；麦芽糖（Glcα（1→4）Glc）和纤维二糖（Glcβ（1→4）Glc）虽然都是（1→4）糖苷键，但因两者的构型不同，其相对水解速率分别为100和40［16］。因此，多糖中单糖降解释放的难易程度不仅与结构类型相关，还可能与糖苷键的连接方式和α／β构型等相关，但与单糖的稳定性不直接相关。因为多糖一旦降解为单糖，其糖苷键连接方式的影响因素就不存在了。

4结论

HTP的单糖组成较复杂，主要由Man、GlcN、Gal及少量GalN、Glc、GlcA、Ara、Fuc共8种单糖组成。不同结构类型的单糖对降解条件的敏感度各不相同：HTP中氨基糖较难降解释放，Ara、Fuc和GlcA易被降解，常见中性糖Man、Gal和Glc的降解释放难易程度介于前两者之间。各单糖在降解过程中的稳定性也存在较大差异（稳定性：氨基糖＞中性糖＞糖醛酸），但多糖中单糖降解释放的难易程度和游离单糖的稳定性不存在必然的联系。因此，采用同一条件降解不能正确测定HTP这类结构较为复杂多糖中的单糖组成，为了保证定量分析的准确性，需要针对氨基糖、中性糖、糖醛酸等不同结构类型的单糖性质，分别采用不同的最适降解条件进行综合测定。

作者：王清池 赵峡 邓世明 单位：中国海洋大学 海洋药物教育部重点实验室 山东省糖科学与糖工程重点实验室 海南大学海洋学院