沙眼衣原体持续感染的研究进程范文
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摘要：沙眼衣原体持续感染是指在不利生长条件下产生的一种可逆状态。持续感染状态下的沙眼衣原体有活力，但呈肿大的异常型，且新陈代谢处于静止状态。包括营养缺乏，合并病毒感染、噬菌体、抗生素效应、细胞因子，疾病和个体及男女差异在内的多种因素都可导致沙眼衣原体持续感染。沙眼衣原体持续感染迁延难愈并可导致严重并发症，故成为目前沙眼衣原体研究的热点。近年来，随着对沙眼衣原体持续感染的不断深入研究，抗生素联合应用、乳胞素、色氨酸分解酶抑制剂等新型药物、免疫调节剂、新型疫苗及噬菌体成为治疗沙眼衣原体的新手段。
关键词：沙眼衣原体；持续感染；分子机制
沙眼衣原体是一种具有专性胞内寄生特征和双相循环发育周期的病原微生物，具有原体和网状体两种形态，前者感染性强，为侵入细胞形态；后者为复制形态，不具有感染性，两种形态可相互转化。目前全世界范围内最常见的性传播疾病病原体就是沙眼衣原体，可引起人体的广泛感染，如非淋菌性尿道炎、宫颈炎、输卵管炎、盆腔炎，此外还能引起其他部位感染如沙眼、关节炎等，并引起较为严重的并发症如宫外孕和不孕不育。有学者提出沙眼衣原体感染可以诱导和促进人乳头瘤病毒持续感染，从而诱发宫颈癌，甚至可能是单独诱发宫颈癌的高危因素之一［1⁃3］。临床上有大量沙眼衣原体感染患者迁延难愈，症状复杂，除部分为重复感染外，其余大部分是持续感染状态，虽然临床上区分持续感染状态和重复感染还比较困难，但无论是体外沙眼衣原体持续感染模型的特征表现还是体内感染的证据都表明慢性病期间沙眼衣原体具有持续形态改变。持续感染是沙眼衣原体免疫逃避的一种形式，为逃脱宿主的免疫防御、外界药物干预及生存环境变差而进入的一种可逆状态，此时沙眼衣原体不再复制、增殖，代谢能力降低，表现为异常增大的网状体，长期存在于细胞内并不再转化为原体。当宿主免疫功能下降、停用药物、生存环境改善、其他病原体感染如疱疹病毒等，沙眼衣原体即退出持续感染状态并重新进入循环发育周期。持续感染是外界因素（如营养缺乏、病毒联合感染、噬菌体、抗生素）、细胞因子、沙眼衣原体免疫逃避以及各因素相互作用的结果，研究持续感染机制对临床治愈沙眼衣原体感染有重要意义。现对沙眼衣原体持续感染及治疗相关国内外研究进展进行综述，以期为临床诊疗和实验室研究提供线索和依据。
1沙眼衣原体体外持续感染的研究
1．1营养缺乏
色氨酸是沙眼衣原体生长发育的必需氨基酸，供给不足会限制其分裂繁殖能力，进而形成沙眼衣原体持续感染状态。沙眼衣原体通过编码色氨酸代谢调节基因对色氨酸生物合成途径进行适当调节，当宿主通过防御机制限制沙眼衣原体色氨酸生物利用度时，沙眼衣原体可以借此机制保持自身色氨酸代谢水平的稳态，宿主细胞缺乏色氨酸较严重时，沙眼衣原体即开启自我保护机制，通过对DNA复制、转录、翻译以及蛋白质生物合成途径的精确调节维持自身完整性并存活，进入持续感染状态［4⁃5］。铁也是沙眼衣原体生长和发育的必需元素之一，铁缺乏时，E型沙眼衣原体网状体不典型，外膜疏松波动，包涵体体积变小，周围包被电子致密物，沙眼衣原体进入持续感染状态；基因组转录应答显示铁缺乏时，沙眼衣原体维持生存所必需的合成代谢正调节，而进一步增殖所需的DNA翻译相关负调节使沙眼衣原体进入存活但不复制的持续感染状态；铁缺乏时色氨酸相关基因正调节，而细胞内铁水平增高时可抑制色氨酸分解酶吲哚胺2，3⁃双加氧酶（indoleamine2，3⁃dioxygenase，IDO）的信使RNA（messengerRNA，mRNA）和蛋白的表达，可见铁不仅是沙眼衣原体生长的必需元素，还是色氨酸分解酶转录水平表达的重要调节因子，间接通过色氨酸代谢影响沙眼衣原体感染状态。此外，单核吞噬细胞系统通过截留铁并阻止其运输到内皮细胞是宿主对抗沙眼衣原体感染的一种保护机制［6⁃9］。但某些情况下，由于宿主内皮细胞铁的缺乏使沙眼衣原体转而侵入富含铁的单核吞噬细胞，单核吞噬细胞内产生的活性物质对沙眼衣原体的灭杀和抵抗形成平衡，成为形成持续感染状态的另一原因，也可能是导致局部淋巴结肿大从而形成性病性淋巴肉芽肿的原因［10］。
1．2沙眼衣原体合并病毒感染
沙眼衣原体与单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）2共同感染可诱导沙眼衣原体进入持续感染状态。流式细胞学检测发现，合并感染细胞内γ干扰素（interferonγ，IFN⁃γ）、肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactorα，TNF⁃α）、IFN⁃α均无释放；半定量逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT⁃PCR）检测IFN⁃γ、IFN⁃β、IDO、淋巴毒素α、诱导型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）均无表达，给予铁、葡萄糖、氨基酸等营养物质无法改变持续感染状态，表明病毒联合感染导致沙眼衣原体持续感染有其单独机制［11］。有报道称HSV⁃Ⅱ病毒颗粒与HSV糖蛋白D特异性中和抗体预孵育可以阻止沙眼衣原体进入持续感染状态，表明HSV糖蛋白D与宿主细胞表面受体的相互作用可能是诱发沙眼衣原体进入持续感染状态的原因，疱疹病毒侵入期间能与HSV糖蛋白D相互作用的宿主细胞表面受体有疱疹病毒侵入介质、结合素1、结合素2和3⁃硫酸化硫酸乙酰肝素4种，其中与衣原体发育成熟相关的表面受体是结合素1，疱疹病毒感染后降低结合素1的表达可能是造成沙眼衣原体持续感染的原因［12⁃13］。
1．3噬菌体
鹦鹉热衣原体菌株是电镜检测中最早发现衣原体属噬菌体，被命名为衣原体噬菌体（chlamydiaphage，Chp）1［14］。此后相继发现了另外5种Chp，包括Chp2、Chp3、Chp4、豚鼠衣原体噬菌体（guineapigchlamydia，CPG1，又名phiCPG1）以及肺炎衣原体AR39噬菌体（chlamydiapneumoniaeAR39bacteriophage，CPAR39）。这些噬菌体的共有特征是具有8个开放式可读框（openreadingframe，ORF）编码基因，基因序列具有高度同源性。目前研究较多的是ORF1、ORF3和ORF4基因，ORF1基因编码衣原体噬菌体衣壳蛋白分子病毒蛋白1（virusprotein1，VP1），VP1主要作用是对宿主细胞的识别，识别区域定位于氨基酸序列区域插入环5和氨基酸序列区域更小插入环；ORF3基因编码VP3，VP3是一种结构蛋白，支撑噬菌体结构；ORF4基因编码噬菌体复制起始蛋白，其中心序列与DNA解旋酶B（DnaB，又名Rep蛋白）相似，能够控制噬菌体DNA合成［15］。Hsia等［16］发现CPG1感染鹦鹉热衣原体后，其原体立即分化为异常增大的网状体并不再复制，延迟转化为原体并进入持续感染状态，增大的网状体成为噬菌体复制和成熟的场所。而网状体内噬菌体的复制与VP3的表达及宿主细胞染色体的复制几乎同步，表明噬菌体的生长发育过程与宿主细胞一致并对其产生影响［17］。由于噬菌体感染衣原体进而导致其处于网状体状态并不再发育为成熟原体的机制目前并不清楚［18］。但有学者认为可能与VP1识别宿主后导致的多种信号传递及相关蛋白表达变化有关，如多态膜蛋白（polymorphicmembraneproteins，Pmp）D，主要外膜蛋白（majoroutermembraneprotein，MOMP）等［19］。
1．4抗生素
体外实验中青霉素、阿奇霉素、环丙沙星、氧氟沙星等均能诱发沙眼衣原体进入持续性状态，可能与抑菌浓度不够、用药不当、疗程不足等有关，但其分子机制尚不清楚，可能与抗生素耐药机制有关，如青霉素可能与衣原体胞壁肽聚糖的合成酶胞壁质酶A亚基（muramidaseAsubunit，MurA）突变有关，MurA控制尿苷二磷酸⁃N⁃乙酰氨基葡糖⁃烯醇丙酮酰转移酶的合成，后者是肽聚糖合成的催化酶，MurA基因突变使青霉素无法破坏衣原体胞壁而不能进行有效灭杀［20⁃22］。阿奇霉素与微生物核糖体的亚单位沉降系数23S的核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）结合从而阻碍微生物的转肽过程，进而能够抑制微生物的蛋白质合成，如衣原体核糖体23SrRNA突变可导致其无法被抑制。四环素类药物通过与核糖体30S亚基结合抑制细菌蛋白质合成，外源基因与衣原体染色体结合使四环素无法与核糖体亚基结合。喹诺酮类可能与DNA旋转酶A亚基（gyraseAsubunit，gryA）基因点突变有关，gryA基因属于喹诺酮类药物耐药区，点突变导致酶结构改变及物理化学变化干扰喹诺酮、酶、DNA三者的相互作用。耐药后的沙眼衣原体不能被有效灭杀，在不利生长环境中开启自我保护机制可能是进入持续感染状态的原因。1．5细胞因子少量IFN⁃γ诱导的持续感染的主要机制也是间接通过色氨酸缺乏完成，机制为IFN⁃γ可激活宿主色氨酸分解酶IDO，使色氨酸分解为犬尿氨酸从而减少细胞内环境中的色氨酸含量［23］。Ibana等［24］发现IDO抑制剂左旋甲基色氨酸（levo⁃1⁃methyl⁃tryptophan，L⁃1MT）能够抑制IFN⁃γ诱导的沙眼衣原体持续感染，并提高多西环素针对沙眼衣原体持续感染的药效。此外，IFN⁃γ可活化宿主细胞产生诱生型iNOS从而增加胞内一氧化氮含量并产生杀灭沙眼衣原体效应，但不同衣原体感染复数（multiplicityofinfection，MOI）引起宿主细胞的反应不同，较低的MOI使IFN⁃γ介导的iNOS产生减少，宿主细胞内沙眼衣原体灭杀不完全并产生抑制作用，可能是导致其进入持续感染状态的重要因素［25］。1．6免疫逃避人衣原体蛋白酶样活性因子（humanchlamydialprotease⁃likeactivityfactor，CPAF）是存在于被沙眼衣原体感染细胞胞质中的蛋白水解酶／蛋白酶活性因子，研究发现由氨苄西林诱导的沙眼衣原体持续感染细胞，导致胞液中CPAF明显减少，但沙眼衣原体分泌的CPAF无明显减少，说明胞液中部分CPAF与作用底物结合发生了免疫逃避，虽然在宿主细胞液内的作用底物尚不完全清楚，但能下调转录因子核因子κB、调节因子Ⅹ5和上游刺激因子1的表达，从而抑制宿主细胞针对沙眼衣原体的免疫反应产生免疫逃避的效果，使CPAF在沙眼衣原体侵入和定植于宿主细胞方面发挥重要作用［26⁃28］。胞液中CPAF与底物结合后抑制宿主免疫反应可能是沙眼衣原体成功免疫逃避并进入持续感染状态的重要原因。有研究发现沙眼衣原体能诱导宿主细胞内的高尔基体碎片进入包涵体并获取养分，胞液内CPAF可能起重要作用［29⁃30］。CPAF是否通过影响养分获取从而诱导沙眼衣原体进入持续感染状态尚需进一步研究。蛋白酶抑制剂乳胞素可以抑制CPAF的水解活性。
2沙眼衣原体体内持续感染的研究
2．1沙眼衣原体体内持续感染的证据
沙眼衣原体在人体内能引起广泛感染，临床表现复杂多样，部分患者病程迁延难愈，可能与沙眼衣原体重复感染或持续感染有关。此前关于沙眼衣原体重复感染和持续感染尚有争议，但Suchland等［31］对长期感染稀有血清型沙眼衣原体患者宫颈样本培养出的菌株进行全基因组测序发现，部分患者菌株基因0突变，而另一部分重复感染患者菌株基因大量突变，揭示了持续感染与重复感染的差异性，进一步证实了体内沙眼衣原体存在持续感染状态。Lewis等［32］对37例感染沙眼衣原体的子宫颈样本进行了分子生物学和形态学分析，进一步发现并分离出处于持续感染状态的沙眼衣原体，这是首次发现体内沙眼衣原体持续感染的直接证据，研究显示人体微环境与IFN⁃γ诱导的持续感染体外模型相似。Eleutério等［33］发现与IFN⁃γ升高相关的单核苷酸多态性（rs2430561）阳性患者宫颈沙眼衣原体感染率较低，但阴性患者感染率较高，提示IFN产生水平的个体差异与沙眼衣原体的生存状态密切相关，也与体外研究结果相吻合。
2．2男女患病差异
流行病学统计发现沙眼衣原体在女性人群患病率更高，有明显性别差异，出现慢性炎症反应及并发症的发生率也更高［34］。除了与男性、女性的泌尿生殖解剖生理不同有关外，还可能与女性生殖道特殊环境、口服避孕药、菌群变化及个体差异性有关。女性经期生殖道环境由于雌激素水平变化导致乳铁蛋白表达的波动可能会导致沙眼衣原体生存环境中铁缺乏，进而使沙眼衣原体进入持续感染状态［35］。乳铁蛋白是可在女性生殖道表达的一种人体内重要的非血红素铁结合糖蛋白，参与铁的转运并具有强大的免疫调节功能。Bright等［36］发现女性口服激素避孕药可能导致宫颈上皮异位并导致激素水平变化，增加对沙眼衣原体的易感性。另有研究显示正常女性生殖道乳酸菌属占据主导地位，能杀死沙眼衣原体并抑制吲哚类物质产生［37⁃38］。细菌性阴道病患者生殖道其他菌属占据主导地位时，可产生大量吲哚类物质，感染生殖道的沙眼衣原体含有色氨酸合成酶A蛋白和色氨酸合成酶B蛋白的紧密连锁编码基因能使生殖道内的吲哚类物质转化为色氨酸，为沙眼衣原体的存活创造条件，因此女性生殖道微生物群落组成的改变也可能影响到沙眼衣原体的感染及存活状态［39］。甘露糖结合凝集素（mannose⁃bindinglectinormannan⁃bindinglectin，MBL）是女性生殖道分泌物免疫系统的组成部分，可与沙眼衣原体表面的跨膜糖蛋白结合，通过补体介导溶解或吞噬作用清除沙眼衣原体，个体差异导致MBL相关基因多态性，可降低MBL水平并增加跨膜糖蛋白感染率及破坏程度［40⁃41］。
3预防及治疗手段
3．1抗生素
美国疾病控制中心性传播疾病的诊断和治疗指南（2015版）关于沙眼衣原体感染的推荐治疗方案：多西环素缓释片200mg，每日1次，7d为1个疗程或阿奇霉素1g，顿服（单次）；替代方案：左氧氟沙星500mg，每日1次，7d为1个疗程或红霉素碱500mg，每日4次，7d为1个疗程或氧氟沙星300mg，每日2次，7d为1个疗程或琥乙红霉素800mg，每日4次，7d为1个疗程［42］。但在临床实践中，部分患者泌尿生殖道沙眼衣原体仍反复而难以彻底清除，因此适当延长用药疗程及合理的联合用药对临床上沙眼衣原体持续感染更有效，抗生素应尽可能选择直接作用于DNA的药物与抑制细菌蛋白质合成的药物联合应用，从而降低耐药现象和不良反应的发生率［43］。
3．2其他药物及联合感染的治疗
营养增补剂色氨酸作为辅助用药进行合理补充使沙眼衣原体脱离持续感染状态，进而应用抗生素治疗可能是有效方法，但需要临床进一步验证；而IDO抑制剂L⁃1MT与传统抗生素类药物的联合应用及蛋白酶抑制剂（如乳胞素等）等新型药物的研究可能为沙眼衣原体的临床治疗提供新的方法［24］。沙眼衣原体感染患者应进行疱疹病毒感染的联合筛查，女性应同时进行细菌性阴道病的筛查，阳性患者应同时进行合理治疗。女性患病期间应避免口服激素类避孕药并尽量维持生殖道菌群的健康，必要时可进行益生菌的补充。
3．3免疫调节
沙眼衣原体持续感染状态与患者免疫功能息息相关，适当应用免疫调节剂（胸腺素、转移因子等）增强患者免疫功能，通过自身免疫系统对沙眼衣原体进行清除也是行之有效的办法。IFN在患者感染沙眼衣原体后引起的免疫反应中具有重要作用，不仅在体液免疫和细胞免疫方面具有调节作用，而且对某些细胞（如巨噬细胞和自然杀伤细胞）具有免疫增强作用。虽然小剂量IFN可以引起沙眼衣原体进入持续感染状态，但较高水平IFN可以降低患者感染率，因此较大剂量的IFN应用也是临床上可以使用的治疗方法［33］。
3．4沙眼衣原体疫苗
很多患者感染沙眼衣原体后难以彻底清除并导致严重并发症，亟需有预防作用或治疗作用的疫苗研究，很多学者和机构投入其中，目前沙眼衣原体疫苗的研究主要包括全菌疫苗和亚单位疫苗。有研究发现，绝大多数衣原体属携带有一种隐蔽性质粒，其ORF编码8种渗透性糖蛋白（permea⁃bilityglycoprotein，Pgp），标记为Pgp1⁃Pgp8，在沙眼衣原体致病力方面有重要作用［44］。Sigar等［45］发现把在泌尿生殖道中分离的沙眼衣原体质粒消除并接种于小鼠，致病力和毒力明显减弱。Conrad等［46］发现染色体基因编码蛋白TC0668／TC0237也是重要致病因子。基于质粒基因消除或部分消除（如Pgp3）、染色体基因TC0668无效突变体以及紫外线灭活沙眼衣原体结合电荷交换合成佐剂颗粒（UV⁃Ct⁃cSAP）的全菌疫苗均不同程度的诱导出了保护性免疫反应，为沙眼衣原体疫苗的进一步发展奠定了基础［46⁃48］。沙眼衣原体感染过程中产生保护性免疫应答的主要是CD＋4T淋巴细胞，基于沙眼衣原体T细胞保护性抗原的亚单位疫苗也是目前研究的热点，主要包括MOMP、CPAF、Pmp（如PorB、PmpD、PmpE、PmpG）以及TC0420等［49］。Bøje等［50］的研究基于MOMP抗原的多基因重组疫苗（Hirep1＋CTH93／CAF01）在哥廷根小型猪模型上成功诱导出Th1细胞介导的免疫反应并产生高效价抗体，避免了猪生殖道沙眼衣原体感染，目前该疫苗已进入I期临床试验阶段，为沙眼衣原体临床预防及治疗带来了曙光。
3．5噬菌体
噬菌体能在宿主菌体内复制增殖并产生大量子代噬菌体，最终裂解细菌，但不会引起正常菌群的失衡。随着对抗生素不良反应逐渐重视及对抗生素耐药的广泛认识，噬菌体疗法有望成为治疗或预防人类感染性疾病的有效手段。目前尚未发现沙眼衣原体噬菌体，但通过对其他噬菌体作用于相应衣原体的机制以及同源性的研究，未来结合基因工程打造沙眼衣原体转基因噬菌体可能成为一种有效的治疗途径［51］。
4小结
针对沙眼衣原体持续感染机制的研究是当前的研究热点，传统研究方向（如营养缺乏、合并病毒感染及抗生素）已经积累了一定的实验室及临床经验。近年来，新的研究方向如细胞因子、免疫逃避及噬菌体尚缺乏大量可重复的实验数据及临床应用。虽然目前沙眼衣原体持续感染的体内外研究结果已经取得了一定进步，但其形成机制尚无统一认识，临床治疗失败病例亦逐年增多。深入开展沙眼衣原体持续感染的实验室及临床研究，找到更好、更有效的临床治疗手段及预防方法，成为广大科研及临床工作者努力的方向。
作者:刘勇；边鹊桥 单位：天津市第三中心医院皮肤性病科