磺胺氯吡嗪钠单克隆抗体制备范文

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《中国动物传染病学报》2015年第三期

1材料与方法

1.1实验动物及试剂BALB/c小鼠，昆明系小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司；磺胺氯吡嗪钠（含量99.97%，批号：091001）、磺胺嘧啶钠（含量99.53%，批号：091001）、磺胺对甲氧基嘧啶钠（含量99.23%，批号：090803）、磺胺氯哒嗪钠（含量99.81%，批号：20091101）、磺胺甲氧哒嗪钠（含量99.50%，批号：20091101）和磺胺二甲嘧啶钠（含量99.55%，批号：090911）购于上海宝山振宗生物工程厂；40%PEG、牛血清蛋白（BSA）和卵白蛋白(OVA)购于美国Sigma公司；NaNO2和盐酸购于国药集团上海化学试剂公司；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为本实验室保存。

1.2磺胺氯吡嗪钠（SPZ）免疫原的制备及鉴定

1.2.1磺胺氯吡嗪钠（SPZ）完全抗原SPZ-OVA及包被原SPZ-BSA的制备通过重氮化方法制备其免疫原及包被原。首先对SPZ进行重氮化反应：称取SPZ10mg，用少量蒸馏水溶解，在4℃条件下同时缓慢滴加预冷的盐酸（0.1mol/L）和NaNO2水溶液（10g/L），并用淀粉碘化钾试纸实时监测，试纸刚变蓝时停止滴加反应液，4℃避光反应10min。取25mg的OVA溶于1mL的碳酸盐缓冲溶液（pH9.6，0.2mol/L）中，离心后取上清，在4℃条件下，逐滴加入NaOH（1mol/L）和重氮化的SPZ溶液，并持续搅拌，保证反应体系的pH值在10左右。4℃避光反应过夜，然后用PBS（pH7.4）透析，每天更换透析液3次，透析3d。将制备的SPZ-OVA分装、标记，-20℃保存。包被抗原（SPZ-BSA）的制备，用BSA替代OVA，其他操作同上。

1.2.2完全抗原鉴定把透析好的免疫原SPZ-OVA和载体蛋白OVA用PBS配制成200ng/mL溶液，将药物SPZ用PBS配制成50μg/mL溶液，用紫外分光光度计分别进行紫外扫描，通过比较药物和偶联物的紫外图谱对偶联结果进行验证。

1.3单克隆抗体制备

1.3.1小鼠免疫取8周龄BALB/c小鼠2只，将SPZ-OVA用弗氏完全佐剂乳化后，足垫注射小鼠进行首次免疫，剂量为200μg/只。随后每2周对小鼠加强免疫1次，用与首次免疫等剂量抗原和弗氏不完全佐剂乳化后，皮下多点注射免疫。细胞融合前3d，小鼠腹腔直接注射SPZ-OVA，250μg/只，进行1次加强免疫。

1.3.2细胞融合及培养细胞融合时取对数生长期小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）和免疫小鼠的脾细胞，以10:1的比例混合置于融合管中，在45s内加入1mL预热的PEG，作用90s后，加入30~40mL预热的不完全DMEM培养基，终止反应。在37℃培养箱中静置10min后离心，弃上清后用含20%胎牛血清（FBS）的HAT完全培养基重悬细胞，将融合细胞悬液滴加到铺有小鼠腹腔巨噬细胞的96孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。融合后注意观察细胞生长情况，融合后d7补加HAT培养基，观察融合细胞生长状况。约10~15d后，待杂交瘤细胞布满孔底约1/5面积时，吸取细胞上清供抗体检测。

1.3.3杂交瘤细胞的初步筛选镜检观察培养孔中细胞克隆生长情况，对孔中细胞克隆不超过3个的进行标记，吸取细胞上清，然后通过间接ELISA测定抗体分泌情况。具体步骤：以0.5μg/mLSPZ-BSA包被酶标板，4℃过夜，用PBST（0.05%Tween-20PBS溶液）洗涤3~4次，每次3min，然后加200μL明胶（10g/L），37℃封闭3h，同上洗涤。加入待测细胞上清10μL，用抗体稀释液（含5%小牛血清的PBST）补液至100μL，阴性对照加100μL抗体稀释液，37℃孵育1.5h，同上洗涤。每孔加入100μL按1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5h，同上洗涤。每孔加入100μL新配制TMP底物显色液，37℃避光反应10~15min，然后加入50μL硫酸溶液（2mol/L）终止反应，测量OD450值，P/N≥2.1为阳性。从阳性克隆中去除其分泌抗体对蛋白载体有反应的克隆，分别以SPZ-OVA、BSA和OVA包被，对阳性克隆再次筛选，将仅对SPZ-BSA显色的孔判为阳性。

1.3.4对细胞阳性克隆进行亚克隆及药物竞争抑制筛选对上述阳性细胞克隆挑选OD450值高且生长状态好的阳性克隆按有限稀释法进行亚克隆，同时用ci-ELISA进行第三次筛选，步骤如下：以0.025μg/mLSPZ-BSA包被过夜，37℃封闭酶标板。取阳性细胞上清2μL用1mL抗体稀释液稀释，称取一定量SPZ用PBS稀释成1000、500、0ng/mL的SPZ标准溶液，在反应孔中依次加入不同浓度SPZ标准溶液和稀释的细胞上清各50μL，其余操作同间接ELISA，得到各反应孔OD450值并计算抑制率。将筛选出的抑制率高的细胞株按有限稀释法继续进行亚克隆，经多次亚克隆，待细胞上清阳性率为100%时，建株并对细胞扩大培养，液氮保存。

1.3.5腹水单克隆抗体的制备取8周龄BALB/c雌性小鼠提前3周腹腔注射石蜡油，每周1次，0.5mL/只。将扩大培养的杂交瘤细胞用葡萄糖生理盐水重悬，于第4周腹腔接种小鼠，约106个细胞/只。接种后每天观察小鼠状态，约10d后可观察到小鼠精神萎靡，腹部膨大。待小鼠濒死不动时用针头收集腹水，离心取上清，－70℃保存备用。

1.4单抗型及亚型鉴定用SouthernBiotech亚型鉴定试剂盒鉴定腹水单抗亚型。按试剂盒说明书操作。1.5单抗（MAb）特性分析

1.5.1MAb的IC50的确定首先用棋盘法筛选出最适包被原浓度（0.01μg/mL）和抗体稀释倍数大致范围，进一步用间接ELISA确定抗体稀释倍数，在此基础上建立间接竞争ELISA（ci-ELISA）。具体步骤：用SPZ-BSA0.01μg/mL包被酶标板，4℃包被过夜，37℃封闭。用PBS稀释SPZ标准品，浓度依次为4000、2000、1000、500、200、100、20、0ng/mL，取上述液体各50μL，加最适浓度的单抗50μL，其余步骤同1.3.3。同样浓度做3个重复，取平均值绘制曲线，计算SPZ半数抑制质量浓度IC50。

1.5.2MAb特异性分析用ci-ELISA的方法检测MAb与其他磺胺药物的交叉反应。称取一定量的磺胺氯吡嗪钠（SPZ）、磺胺嘧啶钠（SD）、磺胺对甲氧基嘧啶钠（SMDZ）、磺胺氯哒嗪钠（SCP）、磺胺甲氧哒嗪钠（SMX）和磺胺二甲嘧啶钠（SM2），用PBS稀释成不同浓度的溶液，进行ci-ELISA测试。根据拟合线性曲线方程，计算各药物IC50，然后计算药物交叉反应率（CR）。交叉反应率=（产生50%抑制时SPZ的浓度/产生50%抑制时其他药物的浓度）×100%。

2结果

2.1人工抗原紫外扫描将SPZ-OVA、SPZ和OVA溶液进行紫外扫描。SPZ在256nm和330nm处有两个吸收峰，OVA在278nm处有吸收峰，偶联物除256nm和330nm两处吸收峰外，在380~400nm有吸收峰，为新生成的偶氮基团的吸收峰，初步证明药物偶联成功。

2.2阳性杂交瘤细胞筛选结果细胞融合后，从阳性克隆中挑选出分泌抗体仅针对SPZ-BSA且OD值高的11株杂交瘤细胞，进行2~4次亚克隆，用ci-ELISA进行竞争抑制筛选，从中筛选抑制率高的5株细胞（表1）。对其多次传代并检测，得到3株稳定分泌SPZ抗体的杂交瘤细胞株，分别为F7C10、F10D9和E11C8。将这3株细胞扩大培养腹腔接种小鼠，收集腹水。对腹水单抗检测，挑选出高特异性的抗体F10D9，简称D9，来进行抗体特性的鉴定。

2.3MAb亚类分型腹水单抗MAbD9能和羊抗鼠IgM-HRP结合显色，所以MAb类型为IgM，轻链类型为κ（表2）。

2.4MAb特性鉴定

2.4.1MAbIC50的确定

2.4.1.1MAb最佳稀释倍数确定在最佳包被原浓度下，将腹水单抗梯度稀释，用间接ELISA确定单抗最佳工作浓度。当包被原的浓度为0.01μg/mL时，对应的MAbD9工作浓度为1:4×105。

2.4.1.2ci-ELISA标准曲线的建立在最佳包被原浓度（0.01μg/mL）和抗体工作浓度（1:4×105）的基础上建立ci-ELISA，对系列浓度稀释的SPZ用ci-ELISA进行测定，以SPZ空白对照孔OD450值为B0，不同浓度的SPZ竞争反应孔OD450值为B，以B/B0值为纵坐标，SPZ质量浓度（ng/mL）的对数值为横坐标，绘制标准曲线。SPZ在20~4000ng/mL范围内，B/B0值与SPZ浓度的对数值呈线性关系，方程为y=-0.3369x+1.347，R2=0.994，IC50=326ng/mL。

2.4.2MAb特异性鉴定MAbD9与磺胺甲氧哒嗪（SMX）无交叉反应（CR<0.01%），而与其余供试药品有较弱交叉反应（CR<10%）。

3讨论

磺胺类药物具有抗菌谱广、价格低廉、使用方便等特点，因而在畜禽生产中广泛应用，而药物的不规范使用或过量使用会造成动物性食品中药物残留，引起系列人类健康问题，如产生耐药性、过敏或毒性反应[12]。因此，食源性产品中磺胺药物残留的检测具有必要性。目前检测磺胺氯吡嗪钠主要采用仪器联用技术，如液质联用LC-MS/MS、气质联用（GC-MS）法、薄层色谱分析法等，灵敏度可满足检测要求，其中LC-MC的最低检测限（LOD）可达到650ng/kg[12]。与理化分析技术相比免疫学检测具有高灵敏度和易操作的特点，在药物残留检测方面具有广阔应用前景。本研究以制备的单抗McAbD9建立的ELISA方法，线性范围在20~4000ng/mL之间。尽管我国对磺胺氯吡嗪钠最大残留限量没有具体规定，但明确规定磺胺类药总残留最大残留限量为0.1mg/kg(相当于100ng/mL)。因而，本研究建立的ELISA对于磺胺氯吡嗪钠超标残留阳性样本可进行有效检测，但灵敏度有待提高，可用化学发光免疫分析技术(CLIA）建立更高灵敏度的检测方法[13]。药物小分子没有免疫原性，SPZ通过和载体蛋白偶联形成完全抗原，才能激发宿主产生相应抗体。

本研究制备的SPZ-OVA免疫小鼠后，小鼠可产生特异性抗体，其效价可达到1:6.4×104，证明合成的人工抗原具有良好的免疫原性。McAbD9对SPZIC50值为326ng/mL，与文献[14]报道的SPZ单克隆抗体的IC50类似。由McAbD9的交叉反应实验可知，所制备的抗体对SPZ的特异性比较强，与其他磺胺药有较弱或无交叉反应。本研究对磺胺母核的氨基用重氮化方法以-N=N-与OVA相联，因氨基可能是磺胺母核的重要抗原表位，以SPZ的氨基为偶联基团的抗原制备的抗体，因失去重要表位而对具有磺胺母核的其他磺胺药几乎没有交叉反应，也可能因为SPZ以磺胺母核端与蛋白载体相连，不能在抗原分子表面突出磺胺母核而被免疫活性细胞最大限度地识别所致。为此，若研制检测磺胺类药的试剂盒，可考虑以磺胺母核为基础设计半抗原，并设法突出于抗原表面，研制类特异性抗体，这种研究思路已有研究表明是可行的[15]。

本研究采用有限稀释法[16]进行融合细胞的亚克隆化，即将待克隆的细胞团在显微镜下标记，用移液枪将细胞吸出，置于96孔细胞板中稀释，在显微镜下计数，选取细胞数约为100个/孔，将该孔细胞加至10mL培养基中，充分混匀后加至铺有饲养细胞的96孔板中进行培养。采用这种方法单克隆率比较高，同时缩短了亚克隆的周期，简单有效。本研究通过对杂交瘤细胞进行筛选后得到的单克隆抗体的效价和特异性对比免疫血清多抗都有了很大提高。

作者：张梦 单位：中国农业科学院上海兽医研究所