阿司匹林对大鼠炎性痛作用范文

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《中成药杂志》2015年第六期

1材料与方法

1.1实验药物水溶性蜂胶(含14.7%总黄酮，广州市杰禾蜂业有限公司，批号20121103-A)，按蜂胶总黄酮量200mg/kg对大鼠给药;完全弗氏佐剂(美国Sigma公司);纳洛酮(Naloxone)注射液(北京四环制药厂，批号20110106);阿司匹林肠溶片(南京白敬字制药有限责任公司，批号121207)，按100mg/kg对大鼠给药［9］;非选择性一氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，美国Sigma公司)。

1.2主要仪器与试剂PL-200热刺痛仪(成都泰盟科技有限公司);BW-YLS-3E电子压痛仪、YLS-7B足跖容积测量仪(上海软隆科技发展有限公司);UV-3200PCS紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);Model-680型酶标仪(美国BIO-RAD公司);BeckmanCoulter微量台式离心机(美国Beckman公司)。NO试剂盒(南京建成生物工程研究所);PLA2、PGE2、TNF-α、IL-6试剂盒(合肥博美生物科技有限公司);其余试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3实验动物清洁级雄性SD大鼠48只，体质量(200±20)g，由合肥蜀山实验动物中心提供，实验动物合格证号:SCXK(苏)2009-0001，笼养3～4d后进行行为学测试和实验，12h～12h明暗周期，室温20～22℃。动物适应性喂养一周。

1.4试验方法

1.4.1实验分组雄性SD大鼠42只，随机分为7组(n=6):正常对照组(NC组)、炎性痛模型组(CFA组)、炎性痛+水溶性蜂胶组(CFA+WSP组)、炎性痛+阿司匹林组(CFA+P组)、炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组(CFA+WSP+P组)、炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组(CFA+WSP+NAL组)和炎性痛+水溶性蜂胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组(CFA+WSP+L-NAME组)。

1.4.2慢性炎性疼痛模型的建立炎性痛模型组(CFA组)，消毒大鼠左侧后肢，用1mL注射器抽取150μL弗氏完全佐剂(Completefreund’sadju-vant，CFA内含0.1%灭活结核杆菌;Sigma)，于左侧后肢足底皮下注射，注射后按压数分钟，以促进药物扩散。正常对照组(NC组)足底皮下注射150μL生理盐水，其余操作同炎性痛模型组。

1.4.3水溶性蜂胶在炎性痛模型中的镇痛作用测定各组大鼠基础痛阈值，每日相同时间点分别给予炎性痛+水溶性蜂胶组、炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组及炎性痛+水溶性蜂胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组大鼠灌胃WSP(蜂胶总黄酮量200mg/kg)，炎性痛+阿司匹林组(大鼠灌胃1mL阿司匹林(100mg/kg)，炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠灌胃WSP(蜂胶总黄酮量200mg/kg)和阿司匹林水溶液(100mg/kg)1mL，NC组和炎性痛模型组大鼠灌胃等容积的生理盐水，连续用药14d;大鼠于炎性痛模型第7天，每日相同时间点，腹腔注射(ip)纳洛酮(4mg/kg)为炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组;腹腔注射(ip)L-NAME(100μg/kg)为炎性痛+水溶性蜂胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组，NC组和炎性痛模型组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水为对照，连续给药7d;其他操作同炎性痛+水溶性蜂胶组，给药1.5h后，分别用PL-200热刺痛仪和BW-YLS-3E电子压痛仪测定各组大鼠的热痛阈潜伏期和机械痛阈值。

1.5行为学测定

1.5.1一般情况测定观察动物每天左后肢变化，如有无红肿，注射部位有无渗液感染等，进食有无影响;观察步态姿势，有无舔咬现象及肢体瘫痪功能障碍，每日测定大鼠体质量。

1.5.2足跖容积测定在每天相同时间点，用YLS-7B足跖容积测量仪分别测定正常对照组及炎性痛模型组大鼠的左侧足跖的容积。

1.5.3热刺痛法测试前让大鼠在较黑暗的环境中适应约5min，待大鼠安静后，移动热辐射光源，使其通过透明玻璃板聚焦于大鼠左后趾足底部皮肤，观察大鼠对热伤害性刺激的反应。当大鼠出现抬足、舔脚反应时的时间为热痛阈潜伏期(Ther-malwithdrawallatency，TWL)。当时间达到30s，而大鼠仍无反应时便停止照射，以免损伤皮肤，并以30s作为最高痛阈。每日于给药后30min测定痛阈，测定时每组循环测定3次，两次时间间隔大于5min，取3次测定值的均数作为大鼠的热痛阈潜伏期。

1.5.4机械压痛法在室温、安静状态下，将大鼠左侧后肢足背部置于压痛仪硅板上，脚踩踏板增加压爪强度，当大鼠出现缩腿、挣扎、嘶叫时，踩下踏板，此时压强为机械压痛阈值(Mechanicalwithdrawalthreshold，MWT)。当机械压痛质量达到250g，而大鼠仍无反应时便停止压爪，以免损伤皮肤，并以250g作为最高痛阈。痛阈测定时每组循环测定3次，2次时间间隔大于5min，取3次测定值的均数作为大鼠的机械压痛阈值。

1.6生化检测及形态学观察

1.6.1大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平的测定于制备炎性痛模型第14天，大鼠颈总动脉取血3～5mL，分离血清，测定其中IL-6、TNF-α及NO水平。

1.6.2大鼠致炎足关节渗出液中PGE2和PLA2水平的测定于制备炎性痛模型第14天，将大鼠处死，在致炎足踝关节上方0.5cm处剪取后足肿胀足爪，纵向切开，放入5mL生理盐水的试管中，4℃浸泡过夜，以3000r/min离心10min，取上清液，严格按照试剂盒说明书采用酶联免疫吸附法检测其中PGE2和PLA2的量。

1.6.3大鼠致炎足及肝脏的形态学观察留取各组大鼠致炎足及肝脏于10%福尔马林溶液中浸泡，进行HE染色观察其形态学变化。

1.7数据处理及分析分别以引起机械痛阈的质量数值(g)、热痛阈的照射时间(s)来表示机械痛阈和热痛阈。采用SPSS16.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(x±s)表示，多组均数比较用单因素方差分析(OnewayANOVA)，两两比较用S-N-K法，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。采用GraphPadPrism5软件作图。

2结果

2.1足跖容积测定炎性痛模型组大鼠左足跖皮下注射完全弗氏佐剂后开始肿胀，足跖容积与正常对照组相比显著升高(P＜0.01)，直至造模后第14天足跖容积仍高于正常对照组(P＜0.01)。结果表明炎性痛模型构建成功。

2.2各组大鼠机械痛阈值与正常对照组相比，炎性痛模型组大鼠注射完全弗氏佐剂后第1天开始机械痛阈值明显下降，持续14d仍存在(P＜0.01)，提示炎性痛模型大鼠存在机械痛觉过敏;同炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组、炎性痛+阿司匹林组和炎性痛+水溶性蜂胶+阿司林组大鼠在灌胃给药第2天后机械痛阈值出现增高，直到造模后第14天差异仍旧存在，差异有显著性(P＜0.05)。如图3所见，给各组大鼠腹腔注射用药前，与正常对照组相比，炎性痛模型组、炎性痛+水溶性蜂胶组、炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组和炎性痛+水溶性蜂胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组大鼠机械痛阈值明显低于正常对照组(P＜0.05)，与炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组大鼠机械痛阈值明显增高(P＜0.01);腹腔注射阿片受体阻断剂纳络酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组大鼠机械痛阈值增高程度被部分阻断，同炎性痛+水溶性蜂胶组相比，差异有显著性，表明腹腔注射阿片受体阻断剂纳络酮能部分阻断WSP对炎性痛大鼠的镇痛作用;腹腔注射非选择性一氧化氮合酶抑制剂L-NAME后，炎性痛+水溶性蜂胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组大鼠机械痛阈值明显高于炎性痛+水溶性蜂胶组，具有统计学意义(P＜0.01)，表明腹腔注射非选择性一氧化氮合酶抑制剂L-NAME后，通过减少炎性痛大鼠外周组织NO的生成，从而增强了WSP的抗炎镇痛效应。见图3。

2.3各组大鼠热痛阈值与正常对照组相比，炎性痛模型组大鼠注射弗氏完全佐剂后第1天开始热痛阈值明显下降，持续14d仍存在(P＜0.01)，提示炎性痛模型大鼠存在热痛觉过敏;同炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组、炎性痛+阿司匹林组和炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠在灌胃给药第2天后热痛阈值亦明显增高，直到造模后第14天差异仍旧存在，有显著性差异(P＜0.05)。给各组大鼠腹腔注射用药前，与正常对照组相比，炎性痛模型组、炎性痛+水溶性蜂组、炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组和炎性痛+水溶性胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组大鼠热痛阈值明显低于正常对照组(P＜0.05)，与炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组大鼠热痛阈值明显明显增高(P＜0.01);腹腔注射阿片受体阻断剂纳络酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组大鼠热痛阈值增高程度被部分阻断，同炎性痛+水溶性蜂胶组相比，差异有显著性，表明腹腔注射阿片受体阻断剂纳络酮能部分阻断WSP对炎性痛大鼠的镇痛作用;腹腔注射非选择性一氧化氮合酶抑制剂L-NAME后，炎性痛+水溶性蜂胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组大鼠热痛阈值明显高于炎性痛+水溶性蜂胶组，具有统计学意义(P＜0.01)，表明腹腔注射非选择性一氧化氮合酶抑制剂L-NAME后，通过减少炎性痛大鼠外周组织NO的生成，从而增强了WSP的抗炎镇痛效应。

2.4水溶性蜂胶联合阿司匹林对炎性痛大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平的影响与正常对照组相比，炎性痛模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平明显增高(P＜0.01);同炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组，炎性痛+阿司匹林组和炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平均显著降低(P＜0.05);同炎性痛+水溶性蜂胶组和炎性痛+阿司匹林组相比，炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平也有明显降低(P＜0.05)，说明WSP通过抑制炎性痛大鼠外周组织炎性因子的释放而发挥镇痛效应，与阿司匹林(P)联合使用其作用增强，具有协同效应。

2.5水溶性蜂胶联合阿司匹林对大鼠致炎足关节渗出液中PLA2和PGE2水平的影响与正常对照组相比，炎性痛模型组大鼠致炎足关节渗出液中PLA2和PGE2水平明显增高(P＜0.01);同炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组、炎性痛+阿司匹林组和炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠患足关节渗出液中PLA2和PGE2水平均降低(P＜0.05);同炎性痛+水溶性蜂胶组和炎性痛+阿司匹林组相比，炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠致炎足关节渗出液中PLA2和PGE2含量明显降低(P＜0.05)。结果表明WSP具有抑制炎性痛大鼠炎性部位PLA2和PGE2的释放而发挥镇痛效应，与阿司匹林(P)联合使用其作用增强，具有协同效应。

2.6HE染色

2.6.1大鼠足跖部病理变化的组间比较正常对照组大鼠左侧足皮下组织结构清晰整齐，无炎性细胞浸润;炎性痛模型组大鼠致炎足皮下结缔组织排列紊乱，大量炎症细胞浸润，水肿明显;炎性痛+水溶性蜂胶组和炎性痛+阿司匹林组大鼠致炎足皮下组织轻微水肿，炎性细胞浸润减少;炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠致炎足皮下组织排列整齐，无明显水肿，炎性细胞浸润减少(见图6)。

2.6.2各组大鼠肝脏病理变化正常对照组大鼠肝细胞为多边形，界限较清楚，细胞体积较大，核仁清楚，肝血窦内可见散在巨噬细胞;炎性痛模型组大鼠肝细胞水肿，肝血窦内大量炎性细胞浸润;炎性痛+水溶性蜂胶组和炎性痛+阿司匹林组大鼠肝血窦内一定量炎性细胞浸润;炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠肝血窦内少量炎性细胞浸润(见图7)。

3讨论

炎症是机体在有害刺激作用下，多种因素导致局部组织细胞损伤的病理过程，也是机体对抗损伤的防御性保护反应。在致炎因素刺激下，细胞膜磷脂酶A2(PLA2)被激活，水解膜磷脂的酯键，释放出花生四烯酸，经环氧合酶作用产生前列腺素，前列腺素E2(PGE2)是其中主要组分，PGE2具有强烈的扩血管作用，从而引起炎症部位组织水肿，炎性渗出，同时还具有致敏痛觉神经末梢，造成痛觉过敏;多种炎症介质和细胞因子调控炎症反应过程，其中一氧化氮(NO)在炎症反应的许多环节中发挥复杂的调节作用，如在细胞间信息传递过程中起信使作用，促炎作用包括舒血管作用，引起炎症部位组织水肿，增加炎性渗出等;TNF-α是一具有重要生物学功能的细胞因子，能激活血管内皮功能，增加白细胞黏附，激活凝血系统，抑制纤溶，激活单核-巨噬细胞释放IL-6和PGE2等炎症介质等多途径发挥其致炎作用。

疼痛是炎症的主要症状，国际上已经将疼痛列为第五生命体征。疼痛的评定主要有痛阈的测定、疼痛的主体评测和客体评测等［12］。慢性炎性疼痛对患者的工作和生活影响较大，现有临床各类抗炎药虽有一定疗效，但均因同时具有不同程度的副作用而限制了其对疼痛的有效治疗，深入探讨炎性疼痛产生的机制，寻求更为有效的治疗方法亟待解决。阿司匹林(P)又称乙酰水杨酸，属于非甾体抗炎药，其通过抑制环氧合酶的活性，使前列腺素等炎症介质生成减少，从而实现其抗炎镇痛作用，由于其本身具有酸性，造成胃肠道的不良反应，限制了其在临床上的广泛应用。蜂胶有“紫色黄金”的美誉［2］，具有多种药理作用，如抗炎镇痛和心血管药理作用等，对蜂胶的抗炎镇痛作用有诸多报道，对其抗炎机制研究也取得了一定的进展，但对于蜂胶抗炎活性研究的药物开发却不尽人意，尤其是在蜂胶与抗炎药物的相互作用研究较少，对于蜂胶与非甾体抗炎药的相互作用尚未见报道。

本实验通过建立炎性痛致炎性疼痛大鼠模型，通过蜂胶总黄酮(200mg/kg)及蜂胶总黄酮(200mg/kg)联合阿司匹林(100mg/kg)对大鼠灌胃(1次/d)，连续14d，采用热痛法和机械压痛法，测定各组大鼠热痛阈潜伏期和机械压痛阈值变化;实验结果显示，与正常对照组相比，炎性痛模型组大鼠注射弗氏完全佐剂后第1天开始MWT和TWL均明显下降，持续14d仍存在，提示炎性痛模型大鼠存在机械痛觉和热痛觉过敏，血清中IL-6、TNF-α及NO水平明显增高，患足关节渗出液中PLA2和PGE2水平明显增高;同炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组、炎性痛+阿司匹林组和炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠在灌胃给药第2天后MWT和TWL均出现增高，直到造模后第14天差异仍旧存在，血清中IL-6、TNF-α及NO水平明显降低，大鼠患足关节渗出液中PLA2和PGE2水平明显降低，差异有显著性;大鼠足跖部和肝脏形态学检测显示，同炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组、炎性痛+阿司匹林组和炎性痛+水溶性蜂胶+阿司匹林组大鼠足跖部皮下组织炎性细胞浸润明显减少，水肿减轻;大鼠肝血窦内炎性细胞浸润明显减少，肝细胞水肿明显减轻。给各组大鼠腹腔注射用药前，与正常对照组相比，炎性痛模型组、炎性痛+水溶性蜂胶组、炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组和炎性痛+水溶性蜂胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组大鼠MWT和TWL均明显低于正常对照组，与炎性痛模型组相比，炎性痛+水溶性蜂胶组大鼠MWT和TWL均明显增高;腹腔注射阿片受体阻断剂纳络酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂胶+纳洛酮组大鼠MWT和TWL增高程度均被部分阻断，同炎性痛+水溶性蜂胶组相比，差异有显著性，表明腹腔注射阿片受体阻断剂纳络酮能部分阻断WSP对炎性痛大鼠的镇痛作用;腹腔注射非选择性一氧化氮合酶抑制剂后，炎性痛+水溶性蜂胶+非选择性一氧化氮合酶抑制剂组大鼠MWT和TWL均明显高于炎性痛+水溶性蜂胶组，具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，表明腹腔注射非选择性一氧化氮合酶抑制剂L-NAME后，通过减少炎性痛大鼠外周组织NO的生成，从而增强了WSP的抗炎镇痛效应。总而言之，实验结果同样证实WSP对炎性痛大鼠有明显的抗炎镇痛作用，联合阿司匹林后，其抗炎镇痛作用明显增强，其机制可能是抑制细胞因子及炎性介质的产生，降低炎症部位组织PLA2和PGE2的产生而实现的，阿片受体途径可能也发挥一定的作用。

作者：王海华 王海珍 曾瑾 姜玉新 王静 周萍萍 单位：皖南医学院生理教研室