尼可地尔在大鼠小肠吸收研究范文

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《医药导报杂志》2015年第十一期

尼可地尔(nicorandil)，化学名N-［2-(硝基氧基)乙基］-3-吡啶羧酰胺，属于钾通道激活剂，具有较强的冠状动脉扩张作用，能增加冠状动脉血流量，显著减少心脏缺血事件发生。临床常用于治疗高血压、冠心病及各类心绞痛，包括劳力型心绞痛和痉挛性心绞痛，并能改善运动耐力，长期服用可显著改善预后，减少主要冠状动脉事件或心血管死亡。《中华人民共和国药典》(2010年版)尚未收载尼可地尔及其相关制剂，并且国内相关文献报道较少。口服药物的主要吸收部位在小肠，药物的吸收除了取决于其理化性质外，还受肠黏膜构造以及肠上皮细胞、肠内酶对药物代谢及屏障作用等影响［3］。因此研究药物口服后吸收部位的特性及吸收机制是评价药物及其制剂生物利用度的关键手段，并可作为研究开发口服剂型及新制剂的基础。笔者在本实验中采用大鼠在体肠道灌流法，研究尼可地尔在大鼠肠道的吸收特性及其吸收动力学，为尼可地尔剂型的合理设计提供生物药剂学依据。

1材料

1．1实验动物斯泼累格•多雷(SpragueDawley，SD)大鼠，雄性，体质量(250"50)g，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心，合格证号:SCXK(鄂)2010-0009，动物使用许可证号:SYXK(鄂)2012-0068。动物饲养于湖北中医药大学实验动物中心，温度18～35℃，相对湿度45%～75%。

1．2药品与试剂尼可地尔对照品(中国食品药品检定研究院，含量＞99%，批号:20120701);尼可地尔供试品(西安立邦制药厂，批号:120917);酚红(国药集团化学试剂有限公司，批号:20140424);甲醇(色谱纯，TEDIA);水为双蒸水;其他试剂均为分析纯。Krebs-Ringer缓冲液(K氏液)，配方参考文献［4］。空白肠循环液(配制好的K氏液经肠循环装置，在已冲洗干净的大鼠肠道循环流过后收集即得)。

1．3仪器Agilent1200LC高效液相色谱仪(G1310A单元泵，G1312A二元泵，G1311A四元泵，G1316A柱温箱，G1314AVWD检测器，Agilent化学工作站);UV-1800型紫外-可见分光光度计(日本岛津);HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂);pHS-3CpH计(上海雷磁仪器厂)。

2方法与结果

2．1HPLC法测定肠循环液中尼可地尔浓度

2．1．1色谱条件色谱柱:AgilentSB-C18(4．6mm×250mm，5μm);流动相:甲醇-水(48∶52);检测波长:254nm;柱温:40℃;流速:1．0mL•min－1;进样量:10μL。

2．1．2标准溶液的制备对照品溶液的制备:取尼可地尔对照品适量，精密称定，置于100mL量瓶，用空白肠循环液溶解并定容，配制成0．101mg•mL－1尼可地尔对照品储备液，4℃冰箱贮存备用。供试品溶液的制备:取尼可地尔及酚红适量，精密称定，用空白肠循环液溶解并稀释，配制成尼可地尔浓度为20μg•mL－1、酚红浓度为20μg•mL－1的混合供试品溶液。酚红供试品溶液的配制:精密称取酚红适量，用空白肠循环液稀释至刻度，配制成20μg•mL－1的酚红供试液。

2．1．3系统适应性实验在上述色谱条件下测定，尼可地尔保留时间约4．77min(图1)。空白肠循环液在尼可地尔峰位置处无干扰。供试品中尼可地尔分离度不低于1．5，理论板数以尼可地尔计不低于5000。重复性RSD为0．95%;日内精密度RSD为0．79%，日间精密度RSD为1．3%、稳定性RSD为0．63%，平均回收率98．2%，RSD为0．93%，方法学研究结果均符合要求。

2．1．4线性关系考察取尼可地尔储备液，稀释成系列浓度对照品溶液，按“2．2．1”项色谱条件进样，记录峰面积。以峰面积对尼可地尔浓度(μg•mL－1)进行线性回归，回归方程为A=4．3363C－1．3314(R2=0．9998)。结果表明，尼可地尔在2．02～60．60μg•mL－1浓度范围内呈良好的线性关系。

2．2肠循环液中酚红浓度的测定

2．2．1测定方法肠循环液中酚红的测定采用紫外分光光度法。在波长范围200～600nm内对酚红溶液进行扫描，酚红在558nm处有最大吸收，其他成分在此处无吸收，对酚红测定无干扰，故选择558nm作为酚红的测定波长。

2．2．2酚红线性关系考察取酚红适量精密称定，加空白肠循环液稀释，配制成系列酚红标准液。分别取上述酚红标准溶液0．5mL置10mL具塞试管，各加入0．2mol•L－1氢氧化钠(NaOH)5mL，摇匀，用孔径0．45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，在波长558nm处测定吸光度(A)，以酚红浓度(μg•mL－1)对吸光度进行线性回归，求得回归方程为:A=0．0135C－0．0039(r2=0．9998)。结果表明，酚红在浓度范围10～60μg•mL－1内呈良好的线性关系。其重复性RSD为0．75%;精密度RSD为0．88、稳定性RSD为0．94%，平均回收率99．4%，RSD为0．51%，方法学研究结果均符合要求。

2．3尼可地尔大鼠在体肠道灌流实验大鼠禁食、正常饮水18～20h。麻醉，背位固定在手术台上，沿腹中线剪开腹腔;选取所需肠段，两端剪口，插管扎紧;用预热至37℃的0．9%氯化钠溶液冲洗肠道，再通入空气排净0．9%氯化钠溶液。先用尼可地尔供试品溶液以5mL•min－1流速循环10min，然后将流速调节为2．5mL•min－1;分别于不同时间点从供试液中分别取样2和0．5mL作为尼可地尔和酚红的待测液，随即补充同浓度酚红供试品溶液2．5mL;按前述方法测定各时间点尼可地尔峰面积值(采用外标法)和酚红吸光度值，按文献［7］方法计算吸收速率常数(Ka)等动力学参数。

2．4尼可地尔大鼠肠吸收影响因素实验

2．4．1不同浓度尼可地尔对大鼠小肠吸收的影响分别取尼可地尔浓度为10，20，40μg•mL－1、酚红浓度为20μg•mL－1的供试品溶液。选取全肠段为考察肠段，按“2．3”项方法操作，每隔30min取样，共取4h，结果见表1。对吸收速率常数进行t检验，结果表明，在不同浓度时，Ka间差异均无统计学意义(P＞0．05)，表明尼可地尔在10～40μg•mL－1浓度范围内吸收量随浓度的增加而增加，无吸附饱和现象，而Ka无显著变化，表明尼可地尔吸收以被动扩散为主。

2．4．2不同肠段对尼可地尔大鼠肠吸收的影响取尼可地尔浓度为20μg•mL－1、酚红浓度为20μg•mL－1的供试品溶液。分别选取十二指肠、空肠、回肠及结肠为考察肠段，按照“2．3”项方法操作，每隔30min取样，共取3h，结果见表2。各肠段Ka按空肠、十二指肠、回肠、结肠顺序依次下降，对不同肠段Ka进行方差分析及两两间多重比较，结果显示差异有统计学意义(P＜0．05)，即空肠为药物吸收的最佳部位，但该药物在整个肠段均有较好吸收。

2．4．3环境pH值对尼可地尔大鼠小肠吸收的影响配制3份K氏液，调节pH值为6．0，6．8，7．4。配制成尼可地尔浓度20μg•mL－1、酚红浓度20μg•mL－1的供试品溶液，选取空肠为考察肠段，按照“2．3．2”项方法进行操作，每隔30min取样，共取3h，结果见表3。对不同pH值条件下的Ka进行t检验，结果表明在不同pH值时，Ka间均差异无统计学意义(P＞0．05)。

3讨论

本研究采用HPLC法测定肠灌流液中尼可地尔浓度，具有简便、灵敏、可靠等特点，符合测定要求。肠灌流实验中水分的吸收可明显影响循环液中药物浓度测定，不能准确反映药物吸收情况;而酚红属强酸性化合物，在小肠中多以离子型存在，不易被小肠吸收，故通过测定酚红浓度来考察肠道对水分的吸收，并以此进一步校正肠灌流液中药物浓度数据。本实验中，以小肠内尼可地尔剩余药量的对数lgD对时间t作线性回归，所得相关系数均＞0．9，线性关系较好，可以认为尼可地尔在大鼠小肠的吸收符合表观一级动力学过程，吸收以被动扩散为主;且在不同药物浓度、不同pH值环境下，吸收速率常数间均无显著差异。药物在不同肠段的吸收实验发现差异无统计学意义，其吸收百分率按空肠、十二指肠、回肠、结肠的顺序逐渐减小，药物在整个肠段仍具有较好吸收;但此项结果仍需进一步实验验证。一般而言，制备缓释、控释制剂的药物需在肠道整段或较长部分具有较好的吸收，根据本研究结果，尼可地尔在整个肠段都有一定吸收，因此将尼可地尔研制成缓释、控释制剂可行。

作者：冯敏 杜娟 林宁 单位：湖北中医药大学药学院