肺炎球菌结合疫苗中的铝含量测定范文

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《药物分析杂志》2015年第十一期

肺炎链球菌在呼吸道的感染可以引起支气管炎、肺炎、中耳炎、鼻窦炎等疾病，如果肺炎链球菌侵入血液则会引起脑膜炎、败血症等更为严重的疾病［1－2］。肺炎链球菌始终是导致儿童脑膜炎、菌血症、肺炎等严重疾病的首位病原菌，是引起鼻窦炎和急性中耳炎的最常见病因，也是出生20d后小儿社区获得性肺炎首位细菌病原。全球疫苗和免疫联盟(GAVI)研究估计了全球小于5岁儿童肺炎链球菌的疾病负担，其中中国每年有174万儿童感染肺炎链球菌，占全球病例总数12%。有效安全的疫苗免疫接种是预防肺炎链球菌感染的有效措施，以荚膜多糖为抗原成分的多糖疫苗在2岁以下婴幼儿中免疫效果不理想，即使在成人中也仅能产生短期、中等强度的保护作用。研究证明将多糖与蛋白载体共价偶联形成结合疫苗，可使多糖由T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，增强多糖的免疫原性，使婴幼儿产生足够的保护力［8］。已经上市的7价肺炎球菌结合疫苗和国内外均在研究开发13价肺炎球菌结合疫苗，磷酸铝/氢氧化铝作为佐剂，能够延长多糖蛋白结合抗原在体内的存留时间，引起炎症反应，刺激淋巴细胞增殖分化，提高免疫效果［9］。目前可用于铝含量测定的方法主要有电感耦合等离子体原子发射光谱(induc-tivelycoupledplasmaopticalemissionspectrometry，ICP－OES)法、电感耦合等离子体质谱(ICPmassspectrometry，ICP－MS)法和化学滴定法等。目前肺炎球菌结合疫苗的质量标准中铝含量的测定均采用化学滴定法(中国药典2010年版三部)，但是该方法灵敏度低，样品消耗量大，测定铝含量的样品单次用量需10mL(20支样品)，并且此方法以肉眼判断终点，人为误差较大。ICP－OES法利用铝元素发出的特征谱线进行样品中铝含量的测定，具有灵敏度高、干扰性小、样品用量小(仅为2mL)等优点。本实验参照中国药典2010年版一部及相关文献，建立了ICP－OES测定13价肺炎球菌结合疫苗中铝含量的检测方法，将微波消解法和0．1mol•L－1盐酸直接处理法进行初步比较，选择简便的0．1mol•L－1盐酸直接处理法预处理样品从线性、重复性、加样回收率、专属性以及溶液稳定性等多方面进行方法学验证，确保方法准确有效可重复，为铝含量检测方法的改进打下基础。

1仪器与试药

1．1仪器电感耦合等离子体发射光谱仪(Thermofisherscientific，Icap6300)购自美国赛默飞世尔公司;微波消解仪购自意大利麦尔斯通公司。

1．2试药未上市的13价肺炎球菌结合疫苗由某企业提供;铝单元素标准溶液(GSB04－1713－2004)，质量浓度为1000μg•mL－1，批号11708，购自中国计量科学研究院;硝酸(微电子级化学品，超净高纯试剂);30%过氧化氢(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;浓盐酸(分析纯)购自ThermoFisher公司。

2方法与结果

2．1方法学的建立

2．1．1仪器工作条件入射功率:1．15kW;冷却气:氩气;冷却气流量:12L•min－1;载气流量:1L•min－1;辅助气流量:0．7L•min－1;样品提升量:1mL•min－1;检测波长:308．215nm。

2．1．2标准工作溶液的制备分别精密量取铝单元素标准溶液5、25、50、75、100μL于不同的50mL量瓶中，用1．3%硝酸溶液稀释并定容至刻度，混匀，得1、5、10、15、20μg•mL－1标准工作溶液。

2．1．3样品预处理方法的选择0．1mol•L－1盐酸稀释处理样品:精密量取样品2mL于50mL量瓶中，用0．1mol•L－1盐酸稀释并定容至刻度，充分混匀，分析前在室温下至少放置24h，即得供试品溶液;微波消解处理样品:精密量取样品2mL于消解瓶中，分别加入浓硝酸2mL，30%过氧化氢1mL，置微波消解仪中密封消解35min;待消解液冷却后，转移至50mL量瓶中，每份样品瓶中加入浓硝酸1mL，并用新制超纯水定容至刻度，即得供试品溶液。每种预处理方法平行制备2份供试品溶液，每份溶液连续进样3次，结果ICP－OES法测得0．1mol•L－1盐酸预处理后的样品铝含量均值为241．125μg•mL－1，RSD为1．84%;ICP－OES法测得微波消解法处理后的样品铝含量均值为239．686μg•mL－1，RSD为4．21%。结果表明，上述2种预处理方法处理样品后用ICP－OES法测定铝含量结果无显著性差异，均适用于13价肺炎球菌结合疫苗铝含量检测，本研究选择用0．1mol•L－1盐酸稀释法进行样品的预处理。

2．2方法学验证

2．2．1线性关系考察取制备好的1、5、10、15、20μg•mL－1铝元素标准工作溶液，按照“2．1．1”项条件进行测定。以铝元素质量浓度(μg•mL－1)为X轴，分析线的响应值为Y轴进行线性回归，得回归方程。结果表明铝元素质量浓度在1～20μg•mL－1范围内，与响应值具有良好的线性关系。

2．2．2重复性试验取样品(批号CN0002)9份，按照“2．1．3”项下用0．1mol•L－1盐酸稀释处理制备供试品溶液，应用ICP－OES法检测，结果铝含量的均值为216．761μg•mL－1，RSD为0．76%，表明此方法精密度良好。

2．2．3回收率试验取已知含量的样品(批号CN0002)9份，用0．1mol•L－1盐酸稀释25倍，各取15mL，平均分为3组，分别加入用0．1mol•L－1盐酸稀释至9．511μg•mL－1铝标准工作溶液5、15和45mL，加入的铝终质量浓度分别为2．3778、4．7555和7．1332μg•mL－1。室温放置24h后，进行测定，计算回收率，回收率均在90%～110%之间。铝含量平均回收率及RSD结果见表1。

2．2．4检出限和定量限将空白对照溶液(去离子水)连续进样11次，按照“2．1．1”项条件测得溶液中铝含量，计算平均值和标准偏差(SD)值。结果显示，空白溶液连续进样11次，测定结果的均值为0．0055μg•mL－1，SD为0．0050μg•mL－1，检出限为0．015μg•mL－1(3SD)，当供试品溶液浓度低于检出限时为未检出;定量限为0．050μg•mL－1(10SD)，当测定结果低于定量限时，样品的测定结果被认为不可靠。

2．2．5专属性考察0．04%氯化钠0．1mol•L－1盐酸、0．1mol•L－1氯化锂0．1mol•L－1盐酸和1．3%硝酸溶液分别作为阴性对照1、阴性对照2和阴性对照3。阴性对照1、2和3放置24h后进行铝含量检测。从结果中可以看出，阴性对照1、阴性对照2和阴性对照3的测定值均低于检出限，说明0．04%氯化钠、0．1mol•L－1盐酸、0．1mol•L－1氯化锂0．1mol•L－1盐酸和1．3%硝酸不影响铝含量的检测。结果见表2。

2．2．6溶液中铝含量稳定性研究取样品10份混合均匀，2～8℃放置，在测定前5d、4d、2d、24h和2h分别按“2．1．3”项下方法制备供试品溶液各3份，室温下放置，用ICP－OES法进行铝含量测定，结果显示5个时间点的测定结果的RSD＜6%，表明0．1mol•L－1盐酸稀释处理的供试品溶液在室温放置5d内铝含量稳定性良好，盐酸处理2h与处理24h无显著性差异。

2．3样品检测取13价肺炎球菌结合疫苗样品3批，按“2．1．3”项下方法以0．1mol•L－1盐酸制备供试品溶液，按照“2．1．1”项条件测得溶液中铝含量，与化学滴定法相比较，结果均在质量标准范围内。见表3。

3讨论

肺炎球菌结合疫苗中添加了铝离子作为佐剂提高免疫效果。根据文献报道，分别考察了0．1mol•L－1盐酸稀释处理和微波消解法处理结合疫苗，结果表明此2种方法处理方法均适用于13价肺炎球菌结合疫苗铝含量检测，本文根据操作简便原则选择0．1mol•L－1盐酸处理样品。本文对ICP－OES法检测铝含量的方法学线性、重复性、回收率(准确度)、专属性和溶液稳定性多方面进行了考察，并且确定了此方法的检出限和定量限。结果显示:线性良好，标准曲线r值大于0．9999;重复性RSD低于1%;回收率均在90%～110%之间;专属性研究发现，溶液中存在钠离子和锂离子均不会影响13价肺炎球菌结合疫苗中铝含量的检测;溶液稳定性结果显示，0．1mol•L－1盐酸稀释的样品溶液铝含量在室温放置5d内稳定性良好。应用ICP－OES法检测样品铝含量，结果显示测定值均在理论值的85%～115%。13价肺炎球菌结合疫苗中磷酸铝作为佐剂，确定铝含量是控制肺炎球菌结合疫苗质量的一项重要质控指标。本试验建立了ICP－OES法检测13价肺炎球菌结合疫苗铝含量的测定方法，该方法准确，重复性好，能够取代中国药典中规定的滴定法测定铝含量，可为13价肺炎球菌结合疫苗的质量控制提供试验依据和参考。

作者：陈琼 王瑾 石继春 王春娥 陈翠萍 叶强 单位：中国食品药品检定研究院