两栖动物皮肤生物活性肽研究进程范文

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摘要:生物活性肽在细胞生理以及机体代谢方面具有重要的调节作用。近些年来，研究者们在两栖动物体的皮肤分泌物中发现大量的生物活性肽。文中在查阅大量的相关文献基础上，对两栖动物皮肤中分泌的生物活性肽的种类、来源、作用机理及相关的生理作用等进行了综述，以期为扩大生物活性肽的研究与应用提供参考。

关键词:两栖动物;生物活性肽;生理功能;药理活性

生物活性肽是指25个天然氨基酸以不同方式排列和组成，分子量＜6ku，对生物机体的生命活动发挥裨益作用或具有生理功能的多肽类化合物的总称［1］。活性肽在细胞生理及机体代谢功能的调节上发挥着重要作用，且这些调节作用几乎参与人体所有的生理活动，如人体的神经系统、循环系统、消化系统以及内分泌系统等多个生命活动［2］。不仅如此，其中许多生物活性肽还存在有原蛋白或其组成氨基酸所不具备的独特的生理功能［3］。因此活性肽有着广泛的药物研发潜力，已经在世界范围内成为一个研究热点。两栖动物是一类在自然界中存在的动物群体，与其他动物相比较两栖动物的皮肤结构特点没有鳞片或毛发的保护，且皮肤内有丰富的腺体(主要包括黏液腺与颗粒腺)分布，而腺体分泌物是两栖动物生物化学物质的主要来源［4］，包括生物活性多肽类、生物碱、生物胺以及甾类化合物等。其中种类最多的是活性多肽和生物胺类，并且两栖动物皮肤活性多肽的种类较多于哺乳动物皮肤分泌的活性种类［4-5］。因此，对从两栖动物皮肤中提取分离出的活性多肽物质的探索已经成为国内外学者的研究热点。目前已经从两栖动物皮肤提取物中分离出的生物活性肽包括抗菌肽、抗氧化肽、缓激肽等。为此，本文对两栖动物皮肤生物活性肽的种类以及生物功能加以说明，为扩大生物活性肽的研究领域提供理论参考。

1活性肽的种类及其生理功能

1．1抗菌肽往往把由生物体产生的具有一定的抗微生物、抗细菌与抗癌细胞等活性的小多肽类物质称为抗菌肽［6］。到目前为止已有上千种的抗菌肽从两栖动物皮肤分泌物中被发现，有资料显示，10余种结构与功能不同的抗菌多肽从单个大蹼铃蟾皮肤分泌物中被提取出来，不仅如此，在种类不同的两栖动物皮肤中贮存的抗菌肽的种类也不相同［7-8］，按照抗菌肽序列的相似性，可将两栖抗菌肽分为gae-gurins，brevinin－1，brevi-in－2，ranalexin，ranatuerin－1，ranatuerin－2，esculentin－1，esculentin－2，alustrin，japonicin－1，japonicin－2，nigrocin－2，rugosins，tem-porin等不同的抗菌肽家族［9］。除此之外，通常都是根据两栖动物皮肤分泌的抗菌肽结构的不同将其分成两大类:含有α－螺旋结构的线性抗菌肽与具有分子内二硫键的环状抗菌肽。1．1．1线性抗菌肽线性抗菌肽的杀菌作用很强。该种肽不存在二硫键，其作用机制是通过静电相互吸引的作用使具有两亲性质的α－螺旋肽上所带的正电荷与微生物细胞膜的磷脂双分子层所带的负电荷结合，从而使抗菌肽进入微生物细胞的质膜内，因此磷脂双分子层的原有结构被破坏，使内溶物流出，最终致使微生物死亡而达到杀菌的目的。Bombinins是第1个被发现来源于两栖动物的典型的α－螺旋抗菌肽。除此之外，tem-porins，dermaseptins，Maximin等也都是α－螺旋［10］。研究表明，这类抗菌肽在抑制与杀死细菌、真菌和原虫等方面都发挥着不可忽视的作用，但对人类的细胞无影响［11-13］。

1．1．2环状抗菌肽环状抗菌肽是因为其C－末端存在两个半胱氨酸残基，从而形成一个分子内二硫键的结构。此种抗菌肽与α－螺旋肽的作用机理相类似，几乎都是破坏微生物的膜结构，使内溶物流出，从而导致微生物的死亡［14］。绝大多数的两栖动物的抗菌肽都属于此结构类型，如bre-vinins，esculentins，japonicin等家族都是含有二硫键的环形肽［15］。除此之外，在日本林蛙Ranaja-ponica中提取到的Japonicin-2与印度虎纹蛙Ranatigerina中提取到的Tigerinin1抗菌肽分子内分别含有一个8肽环与一个9肽环［9-16］。

1．2抗氧化肽两栖动物是由水中过渡到陆地生活的代表性生物，鉴于其皮肤是裸露在外部的特殊结构，对于其是如何抵御来自大自然强烈的紫外线照射的氧化威胁，又是如何免受空气中的自由基的伤害就成为了众多学者想要探究的课题。经研究发现，抗氧化肽具有清除机体内自由基，维持细胞器正常功能，使机体保持稳态的重要能力［17］。抗氧化肽的作用机制是以“第三套抗氧化系统”［18］来命名的一种新的防御机制，而对于此新的防御机制具体是如何进行的还未有明确的报道，依然有待于探究。目前抗氧化肽的种类已经在多种两栖动物皮肤中被提取分离得到。有研究者已从滇蛙(R．pleuraden)的皮肤分泌物中提取分离到了11个来自不同家族的抗氧化多肽，并且对其一级结构进行分析，结果发现这些抗氧化多肽存在高度同源的信号肽区域，但是也同时发现这些成熟肽区域又存在很大的差异性，所以也给出了这些抗氧化多肽可能来自于共同祖先的结论［18］。除此之外，在大绿蛙与林蛙等的皮肤中也发现了多种来自不同家族的抗氧化多肽［19-20］，而且也证实了这些抗氧化多肽能在很短的时间内清除大部分自由基。在两栖动物皮肤分泌物中发现抗氧化多肽的研究成果为其在医疗事业领域的应用开辟了新途径。

1．3缓激肽缓激肽主要是激肽释放酶－缓激肽系统中最终降解为含有C—CO2H残基的一类多肽［21］，且缓激肽在体内的半衰期很短，一般＜0．5min［16］。缓激肽是通过β1和β2两种不同的受体发挥其生理作用，其中动物体内β2受体分布范围比较广泛，而且缓激肽大多情况下是通过β2受体对心脏进行保护作用的［22］。研究者通过试验发现，去除小鼠的缓激肽的β2受体后，引起了小鼠心力衰竭及扩张性心脏病［23］。虽然β1受体的含量少，对缓激肽无应答作用，但却对缺失第9个氨基酸残基的缓激肽或另一些des－Arg相似物发挥应答作用。如缓激肽可以通过β1受体对大鼠的离体回肠纵纹平滑肌起收缩作用［24］。有报道结果显示，目前已经从多种两栖动物中发现了缓激肽的存在。如在大蹼铃蟾皮肤中发现了由19个氨基酸残基组成的新型缓激肽Bom-binaininM［25-26］。在蛙属(Rana)与铃蟾属(Bom-bina)皮肤中分离得到了10多种缓激肽，且研究证实这些缓激肽在扩充血管，调节血压浓度以及抗心肌缺血等方面都发挥了不可忽视的作用［27-28］。除此之外，从中国林蛙皮肤中也分离得到了缓激肽［29］。与哺乳动物相比，两栖动物中的缓激肽的生物合成途径与其前体物质生物合成酶的加工过程有待进一步探索。

1．4促胰岛素释放肽促胰岛素释放肽是可调节机体内胰岛素分泌的一类活性肽，具有降低血糖的作用。近几年来已经分离出多种来源不同的促胰岛素释放肽，并且目前在两栖动物中也发现并分离得到了多种不同结构的促胰岛素释放肽。在棕点湍蛙皮肤中提取分离得到了amolopin－1促膜岛素释放肽，从云南小狭口蛙皮肤中分离得到了促胰岛素释放肽。另外，从多彩铃蟾(Bombinavariegate)，无指盘臭蛙(Odorranagraham)，豹蛙(R．pipiens)等蛙类中也发现了多种促胰岛素释放活性肽［30-34］。此外，研究发现，有些两栖动物的抗菌肽不仅具有抗菌性，还具有促胰岛素释放活性。如在树蛙皮肤中得到的抗菌肽Plasticin－L1，除了具有抗菌活性外，还具有促进胰岛素释放的活性［35］。

1．5神经肽目前已经在两栖皮肤分泌物中提取得到的神经肽有蛙皮素、雨蛙肽、皮啡肽、速激肽、Deltorphin肽、色胺酰肽以及杂类神经肽等，这些神经肽在两栖动物的机体内发挥着重要的生理作用［36-39］。

1．6香偶素1995年，从雄性蝾螈体内分离得到第一个属于脊椎动物的香偶素，并命名为sodefrin，研究发现，此种活性肽可吸引雌性动物并具有特异性。在两栖动物繁殖季节里，香偶素在其皮肤中的含量可达到1%，而在非繁殖季节则会下降到＜0．1%［16，40］。

1．7其他活性肽目前研究发现澳洲Litoria与Uperoleia的蛙类皮肤分泌物是两栖动物抗癌肽的主要来源。抗癌肽主要由α－螺旋结构的Aurein家族与16个氨基酸残基组成的C端酰胺化的Citropin家族组成。Aurein和Citropin都是具有较强抗癌活性的活性肽［10］。从Bombinabombina的皮肤分泌物中得到了一类多肽化合物，命名为Bombesin，此后在其他蛙种中提取到了结构和功能与Bombesin相似的多肽ranatensin，litorin与phyllolitorin。Bombesin作用于平滑肌，致使血管紧缩，抑制尿液分泌，而且在治疗神经系统疾病方面具有良好的效果［41-42］。发现的两栖动物皮肤分泌的活性肽除了上述的种类之外，还有其他研究者提取获得了胰蛋白酶抑制剂［43］、免疫活性肽［44］、降压肽［45］、爪蟾肽、抗精子活性的BV8肽［46］等生物活性物质，两栖动物皮肤分泌物的生物活性肽种类繁多，结构功能各异，这些生物活性肽对自然界生物的进化以及医疗事业的发展都起到了非常重要的促进作用。

2活性肽的提取与分离纯化方法

2．1活性肽粗提物的提取方法

2．1．1直接提取法在早期对两栖动物皮肤活性肽的浸提最常用的两种有机溶剂是乙醇与甲醇两种。此种方法的步骤一般都是把活体动物处死之后迅速剥皮并剪碎匀浆，再利用有机溶剂浸提，获得的溶液经过离心取上清进行冷冻干燥之后的物质为活性肽的粗提物。徐兴军等［47］运用酸化乙醇从中国林蛙与中华蟾蜍的皮肤中浸提出抗菌肽的粗提物，通过抑菌试验证明，两种皮肤的抗菌肽对枯草杆菌均有很强的抑制作用，并且发现中华蟾蜍的皮肤粗提物对枯草杆菌的抑制作用优于中国林蛙的。

2．1．2诱导提取法直接提取的方法操作虽然简单，但是此法会导致两栖动物的死亡且产物得率较低，目前，采用温和诱导法(包括电刺激、乙醚刺激或注射去甲肾上腺激素等)刺激两栖动物皮肤颗粒腺体的方式获得其皮肤分泌物。这种方法不需要处死两栖动物，可重复收集活性肽，主要操作过程是采用温和诱导方法刺激两栖动物使其皮肤产生大量分泌物，然后用去离子水或者含有低浓度的三氟乙酸的水溶液冲洗动物体皮肤，收集分泌物，再经过离心获得上清液，冷冻干燥后的物质为活性肽的粗提物。杨红玲等［48］应用乙醚刺激法从锄足蟾蜍科小角蟾的皮肤毒素中提取出了含有抗微生物能力的活性肽Megin1和Megin2。徐佳佳［49］利用电刺激方法从东北林蛙皮肤上获得了抗菌肽。

2．2活性肽的分离纯化方法将两栖动物皮肤活性肽的粗提物进行分离纯化的方法主要有凝胶过滤色谱、离子交换色谱与高效液相色谱3种方法，虽然用单一的分离方法可以使不同的活性肽分离开，但是通常采用的是几种方法组合使用，这样可以使不同的活性肽达到更好的分离效果。

2．2．1凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱是利用分子筛原理将不同分子质量的活性肽进行分离的一种方法。此法操作简单并且蛋白质不易变性。王利峰等［50］利用SephadexG－50和SephadexG－25两步凝胶过滤步骤将大鲵皮肤分泌物中的抗菌肽进行了分离。

2．2．2离子交换色谱根据待分离物质的带电性质及带电量的差异将不同物质进行分离的一种色谱方法。大部分的活性肽都是阳离子，因此可以运用此方法对两栖动物皮肤分泌的活性肽进行分离。Lai等［12］利用DEAE－SephadexA－50离子交换色谱与SephadexG－50凝胶过滤色谱相结合，在中国红蟾蜍皮肤分泌物中分离出了5种抗菌肽。

2．2．3高效液相色谱目前，越来越多的研究者采用高效液相色谱法对两栖动物皮肤的活性肽进行分离，此法比较迅速高效。范译文［51］利用制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱结合方法从野生黑斑蛙的皮肤中分离出了抗菌肽。冯浩等［30］利用SephadexG－50凝胶过滤色谱与反相高效液相色谱相结合的方法从棕点湍蛙皮肤分泌物中分离出了促胰岛素释放肽。

3问题与展望

虽然目前已经从两栖动物皮肤分泌物中鉴定出了多种活性肽物质，并且部分的生物活性也已经知晓，但是其在两栖动物体内相关的生物学功能与作用机理还有待进一步探究。而且由于某些特殊的生物活性物质在两栖动物体内的分泌量少，因此在今后的研究中可以考虑寻找更多的生物替代资源或者应用人工合成技术扩大需求量。

作者：常雷；陈宁宁；岑欣桉；卫功庆 单位：吉林农业大学动物科学技术学院