纤维蛋白黏合胶预防干眼症研究范文

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《眼科新进展杂志》2016年第一期

【摘要】

目的研究纤维蛋白黏合胶黏合泪道对雄兔去势所致干眼症的缓解作用。方法选择新西兰白兔36只(36眼，均为右眼)，剪除第三眼睑后，3g•L－1氧氟沙星滴眼液滴眼1周，随后继续适应性喂养1周，取24只雄兔制作去势雄兔干眼症模型，随机分为A、B两组(各12眼):对照组(A组)泪道注射生理盐水，实验组(B组)泪道内注射纤维蛋白黏合胶。剩余12只(12眼，C组)雄兔切开阴囊，不切除睾丸，眼部不予处理，作为假手术组。分别于注射前和注射后2周、4周及8周行SchirmerⅠ试验(SchirmerⅠtest，SⅠT)、角膜荧光素(fluesce-in，FL)染色、泪液蛋白测定，并于注射后2周、4周对B组泪道黏膜进行K16免疫荧光染色及WesternBlot检查。结果C组注射前及注射后各时间段各项检测差异均无统计学意义(均为P＞0．05)。注射后2周、4周及8周，A、B两组SⅠT、FL染色评分、泪液总蛋白含量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性较注射前均有不同程度下降，其差异均有统计学意义(均为P＜0．05)，但注射后2周及4周B组SⅠT、FL染色评分下降程度较轻，与A组下降程度相比差异均有统计学意义(均为P＜0．05)。而B组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性则在注射后4周出现下降减缓，与A组相比差异均有统计学意义(均为P＜0．05)。免疫荧光染色和WesternBlot结果显示B组下睑泪道黏膜K16阴性表达。结论使用纤维蛋白黏合胶黏合泪道可较快而明显地改善干眼的症状和维持泪液蛋白成分，从而延缓去势雄兔干眼症的进展。

【关键词】

纤维蛋白黏合胶;干眼症;泪液蛋白

干眼症是由于泪液的量、质或流体动力学异常引起的泪膜不稳定和眼表面损害，导致眼部不适及视功能障碍。干眼症患病率逐年上升，严重影响着患者视力和生活。流行病学研究显示，干眼症在我国的发病率与亚洲其他国家类似，较美国及欧洲国家高，其发生率为21%～30%［1］。目前国内治疗干眼症方法有:人工泪液滴眼，对轻度干眼症可以取得较好效果，但对中重度干眼症效果不好，且频繁滴眼导致人工泪液中防腐剂损伤眼表结膜囊杯状细胞加重干眼;泪小点封闭是治疗重度干眼症的有效方法之一，但使用激光封闭不仅带来疼痛不适，而且留下瘢痕手术不可逆。泪小管/点栓塞是目前较好的泪道封闭技术，使用物理阻塞的方式减少泪液流失可以改善眼表微环境，缓解干眼症状，手术可逆，但泪道栓子价格较贵、给患者带来一定的经济负担，也可能继发泪小管炎等并发症。纤维蛋白黏合胶是以血纤维蛋白为原料制备的，模拟凝血过程而起到止血作用，同时具有黏合作用，有愈合好、吸收好的优点，现已应用于眼科临床;而目前将其用于封闭泪道方向的实验研究国内外尚未见相关报道。本研究将纤维蛋白黏合剂用于黏合泪道，并与生理盐水进行对比研究，探讨纤维蛋白黏合胶在治疗干眼症损伤中的应用效果，为以后提高干眼症的临床治愈率提供一定的实验依据。

1材料与方法

1．1实验材料纤维蛋白黏合剂(上海莱士血制品有限公司)，SchirmerⅠ试纸(博士伦公司)，聚氯乙烯塑料薄膜、滤纸(上海半岛实业有限公司)，K16抗体(美国Sigma公司)。

1．2动物分组及手术成年健康新西兰白兔36只，1．5个月龄，均为雄性，体质量1．5～2．0kg(实验动物由南昌大学医学院动物实验部提供)。使用裂隙灯显微镜和眼底镜检查眼前节及眼底无异常，同时Schirm-erⅠ试验(SchirmerⅠtest，SⅠT)≥10mm/5min。将健康新西兰白兔36只剪除第三眼睑，3g•L－1氧氟沙星眼液滴眼1周后继续适应性喂养1周。参照马轶群等［2］的方法，将24只雄兔行双侧睾丸切除术(chiec-tomized，ORX)后随机分为2组(每组12只，均为右眼):A组泪道内注射生理盐水、B组泪道内注射纤维蛋白黏合胶。余12只(12眼，C组)雄兔切开阴囊，不切除睾丸，眼部不予处理为假手术组。

1．3手术方法A组和B组分别于兔泪小管段注入生理盐水及纤维蛋白黏合胶，具体注入方法参考文献［3］:B组使用4g•L－1盐酸奥布卡因(倍诺喜)滴眼液滴眼1次进行表面麻醉，一手持棉签轻轻压迫下眼睑内侧，暴露下泪点，另一手持双联注射器将头端连接的泪道冲洗针自下睑结膜泪点进针，顺泪管前进约2mm，注射纤维蛋白黏合胶0．2mL(冻干人纤维蛋白原和冻干人凝血酶各0．1mL)，边注射边拔针。以棉签拭去溢出的胶体，用无菌玻璃棒轻压泪小点局部约30s。裂隙灯观察泪点外无溢出凝结的胶体后局部滴3g•L－1氧氟沙星滴眼液。A组同法泪道内注入生理盐水0．2mL。C组白兔眼部不作处理。3组白兔于注射前、注射后2周、4周及8周行SⅠT检查、角膜荧光素(fluescein，FL)染色及泪液蛋白测定。同时注射前、注射后2周及4周处死B组实验兔各2只，解剖分离兔术眼泪道黏膜组织，并对其进行角蛋白16(keratin16，K16)的免疫荧光染色和WesternBlot检测。

1．4SⅠT检测及FL染色SⅠT检查方法:取有刻度的试纸5mm×35mm，一端反折5mm，放入被测眼下结膜囊的中外1/3处，静待5min后取出滤纸，测量湿长。参照文献［1］的标准，以≥10mm/5min为正常。每次检查应注意控制变量，应由同一操作者在相同时间、地点、照明亮度、湿度及温度下操作FL染色检查方法:将1滴10g•L－1荧光素钠滴眼，嘱其瞬目，评分系统参考文献［4］分为0～3级:无染色(0级);很少的播散性污渍染色(1级);中度污渍染色(2级);重度融合性污渍染色(3级)。

1．5泪液蛋白测定于上午9点到11点收集泪液样品，毛细吸管吸取兔下泪河约20μL非刺激性泪液，置于－80℃冰箱中0．5mLEP管(Eppendf，Fremont，CA)保存。以小牛血清白蛋白为标准，Brandfd法测定泪液总蛋白含量。使用4，6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷(EPS-PNP-G7)测量淀粉酶活性(LeadmanGroupCo．，Ltd．，北京)［5］。双色读数在405nm和546nm采用自动生化分析仪分析(LX20;Beckman，Fullerton，CA);采用放射免疫分析法测定乳铁蛋白［6］:取泪液样品10μL，用生理盐水1∶100稀释，制作标准曲线后计算出乳铁蛋白含量。采用试管比浊法测定溶菌酶含量，溶菌酶测试盒、制备染色菌液、配制溶菌酶标准液及绘制标准曲线均按说明书进行;将泪液与染色菌液混匀，离心后取上清液，根据测定管与样品对照管光密度差值，查标准曲线得出样品中溶菌酶含量。

1．6免疫荧光染色(1)将B组注射前、注射后2周及4周白兔泪道黏膜组织冰冻切片取出复温，常温下晾干;(2)PBS洗净:10min×3次;(3)羊血清封闭:37℃45min;(4)孵育一抗(K16，羊抗兔)，4℃过夜，一般要大于18h;(5)4℃PBS洗净，10min×3次;(6)二抗(FITC标记IgG，羊抗兔)避光37℃1h;(7)37℃PBS洗净，10min×3次晾干;(8)OLYMPUS共聚焦显微镜拍照。

1．7WesternBlot检查选择80g•L－1SDS-PAGE胶电泳分离煮过的泪道黏膜蛋白质组织样品(B组注射前、注射后2周及4周白兔泪道黏膜组织)，55mA电泳大约2h直至溴酚蓝到达凝胶底部，PVDF膜甲醇溶液浸润，稳流电转30min～1h。电转后去除电泳胶，将PVDF膜放于明胶(浓度为2．5g•L－1)封闭液中，室温缓慢进行30min摇晃或在4℃封闭液内封闭过夜，加入一抗溶液(K16，浓度为1∶150)，室温孵育1～2h或4℃孵育过夜，用TBST冲洗3次，与一抗(K16，浓度为1∶150)相对应的带辣根过氧化物酶的二抗溶液(浓度为1∶150)，室温孵育1～2h或4℃孵育并进行过夜，TBST3次漂洗，增强型化学发光剂浸润自显影。

1．8统计学方法采用GraphPadPrism4．0统计软件处理实验数据，计量资料以x珋±s表示，计数资料用χ2检验;各组注射前后及两组间同一时间点的均数比较采用student-t检验及Dunnetttest检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2．1治疗前后及两组间各项干眼检测指标评定结果比较C组注射前、注射后2周、4周及8周SⅠT和FL染色评分相比差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。A、B两组泪道处理前，SⅠT和FL染色评分相比差异均无统计学意义(tSⅠT=0．712，tFL=0．352，均为P＞0．05);治疗2周、4周及8周后，B组SⅠT和FL染色评分较治疗前稍有改变，差异均有统计学意义(tBSⅠT=0．874、0．716、0．538，tBFL=5．162、7．378、8．743，均为P＜0．05)，而A组SⅠT和FL染色评分较处理前明显恶化，差异均有统计学意义(tASⅠT=6.125、7．117、10．267，tAFL=4．642、6．157、8．196，均为P＜0．05)。A、B两组在注射后2周、4周时SⅠT和FL染色评分相比，差异均有统计学意义(tSⅠT=3.231、5．163，tFL=4．581、9．174，均为P＜0．05)，但A、B两组在注射后8周时SⅠT和FL染色评分相比，差异均无统计学意义(tSⅠT=1．102，tFL=0．984，均为P＞0．05，见表1)。

2．2两组用药前后各时间点泪液蛋白比较C组注射前、注射后2周、4周及8周泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比差异均无统计学意义(均为P＞0．05)。处理前A、B两组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比较，差异均无统计学意义(t=0．953、0．824、0．613、0．520，均为P＞0．05);注射后4周，B组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与注射前相比差异均有统计学意义(均为P＜0．05)，注射后2周和8周，泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与A组相比差异均无统计学意义(均为P＞0．05)，而A组在各个时间点泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与处理前相比均有不同程度下降，差异均有统计学意义(t=7．501、8．152、8．982、9．420，均为P＜0．05);A、B两组注射后4周泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比，差异均有统计学意义(均为P＜0．05，见表2)。

2．3纤维蛋白黏合剂黏合泪道在兔干眼症中应用效果B组纤维蛋白黏合剂黏合泪道前，泪道黏膜K16呈阴性表达(图1A)，纤维蛋白黏合剂黏合泪道2周后，兔下睑泪道管口黏合，不通畅，而取其下睑泪道黏膜进行K16染色呈阴性表达(图1B)，纤维蛋白黏合剂黏合泪道4周后，兔下睑泪道管口敞开，泪道通畅，而取其下睑泪道黏膜进行K16染色，发现K16在泪道黏膜上皮几乎无表达(图1C)。WesternBlot结果显示去势雄兔纤维蛋白黏合剂黏合泪道处理前、处理后2周、4周兔泪道黏膜K16表达情况见图1D。

3讨论

由于干眼症发病机制仍不清楚，临床将干眼症分为水样液缺乏型干眼症和蒸发过强型干眼症，目前基于病理生理机制建立干眼模型已被用于实验研究。新西兰兔共有三对泪腺即主泪腺、第三眼睑上腺和第三眼睑下腺。主泪腺以浆液性为主的混合性腺，第三眼睑上腺为浆液性腺，第三眼睑下腺是皮脂腺，分泌泪膜脂质层以保护眼球表面及结膜囊［7］，手术摘除第三眼睑可以降低水液层及脂质层分泌，但模型形成时间较长，为缩短模型准备时间可同时建造去势动物模型。眼部是性激素作用的靶器官之一，雄激素、雌激素、孕激素和催乳素受体广泛存在于人、兔和鼠的泪腺、睑板腺及角膜等眼表组织［8］，性激素随年龄变化而降低是干眼症发病的主要原因之一，对雄兔行双侧睾丸切除后，可出现泪腺上皮细胞萎缩，腺泡泡状黏液消失及结膜杯状细胞减少。

两种方式相结合诱导动物模型在泪液分泌的质量改变及泪膜稳定性降低更为严重，缩短了建模时间。刘祖国等［9］认为眼表(角膜、结膜、副泪腺和睑板腺)、主泪腺和它们之间的神经连接组成的泪腺功能单位共同发挥对泪腺分泌和泪膜形成的调控作用，维护眼表的健康，其中任何环节的损害均可导致泪膜完整性和正常功能的破坏，如这些因素不能消失，则引起眼表的病理改变。使用泪道栓塞治疗干眼机制较为明确:增加泪液储留，改善眼表微结构，避免了免疫蛋白和离子成分流失，提高了眼表防御能力，也保护了泪腺、结膜杯状细胞，促进泪液和黏蛋白分泌，增加泪膜稳定性，同时可以减少人工泪液和其他治疗性药物的流失，减少用药频率。国内临床上使用泪道栓子多为进口产品、价格高，且有可能引起继发泪小管炎等并发症。纤维蛋白黏合胶具有黏合迅速、刺激小、反应轻的特点，凝结成的纤维蛋白胶体可被组织释放的纤维蛋白溶解酶逐渐降解并且价格低廉，是作为泪道封闭的理想材料。

本实验表明，B组在用药2个月后可明显改善去势雄兔SⅠT，表明泪道封闭后眼表泪液量增加使眼表刺激症状缓解，并且修复泪膜功能;而A组SⅠT明显恶化，可能与干眼症的进行性加重有关;其次，B组泪液蛋白含量与处理前相比未见明显改变，而A组泪液蛋白含量明显下降，李军等［10］认为干眼症患者泪腺的分泌功能不足是造成泪液蛋白浓度降低的原因，其研究还显示泪液中乳铁蛋白与BUT呈正相关，可能原因是纤维蛋白黏合胶封闭泪道使泪液分泌水平上升，延缓了干眼症的发生，维持了泪液蛋白的稳定，而A组干眼症恶化使泪液蛋白分泌减少或成分丢失变异;再次，B组FL染色评分改善而A组明显恶化，Benelli［11］发现使用人工泪液能减少CSF评分和结膜充血，延长泪膜破裂时间，促进角膜上皮细胞再生润滑眼表，减少摩擦和泪液蒸发，有助于眼表组织修复。本实验通过纤维蛋白黏合胶行泪道封闭使SⅠT增高，比人工泪液更有利于角膜损伤的修复，改善眼表环境，维持角膜表面光滑，为正常视力提供了基本保障。

细胞角蛋白是角质细胞的主要骨架蛋白，主要表达于上皮细胞，目前已经证实的细胞角蛋白有20多种，随细胞类型和分化程度不同而表达类型有差异，其中K16表达在过度增生的上皮及有关疾病组织中，如皮肤病、口腔黏膜病等，刘祖国等［12］研究通过对比正常结膜及翼状胬肉组织中K16的表达情况，发现正常结膜上皮K16染色极弱或阴性，而胬肉组织中K16全层表达，提示结膜上皮细胞增生活跃及过度角化是引起翼状胬肉的另一重要分子机制。本实验检测兔泪道黏膜组织中K16的表达情况，发现纤维蛋白黏合胶组黏合泪道后2周和4周K16在泪道黏膜上皮均呈阴性表达，这提示泪道黏合过程中不伴随泪道黏膜上皮的异常增殖及过度分化，由此我们推测黏合泪道这可能仅仅是一个物理过程，并不影响K16的表达。综上所述，对于去势雄兔干眼症，纤维蛋白黏合胶黏合泪道可较快而明显地改善干眼的症状和维持泪液蛋白成分。它是一种安全有效、给药途径简单、副反应少且廉价的治疗干眼的方法，具有广泛临床应用及推广价值。

参考文献

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作者：杜娟 姜楠 邵毅 胡佩宏 张颖 魏荣 刘新华 裴重刚 单位：佛山市顺德区第一人民医院 南方医科大学附属顺德第一人民医院眼科