长链非编码在肝细胞肝癌中的意义范文
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摘要：目的探讨lncRNACCAT1在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义。方法采用荧光定量PCR检测检测96例肝癌癌灶组织及癌旁组织中lncRNACCAT1的表达情况，并分析与各临床病理因素以及患者预后的相关性。结果lncRNACCAT1在肝癌癌灶组织表达升高;肝癌癌灶组织中lncRNACCAT1表达量和门静脉癌栓、TNM分期等因素相关。进一步生存分析发现lncRNACCAT1表达阳性者术后平均生存时间(32．1个月，95%CI:26．3～38．0个月)明显短于阴性患者(47．2个月，95%CI:42．5～52．0个月)，差异有统计学意义(χ2=7．607，P=0．006)。并且lncRNACCAT1表达是肝癌患者总体生存的独立危险因素。结论lncRNACCAT1表达在肝癌发生、发展中发挥重要作用;lncRNACCAT1表达是肝癌患者的独立预后因素。
肝癌是世界范围内的高发恶性肿瘤之一，尽管随着现代医疗技术的进步，肝癌的诊疗手段已渐趋成熟，但是其术后5年复发率仍高达80%，每年约有超过600000人死于肝癌，缺乏有效的诊疗、监测靶点是造成肝癌患者预后低下的原因［1］。长链非编码RNA(longnon－codingRNA，lncRNA)是一组长度＞200个核苷酸、缺少完整的开放阅读框和无蛋白质编码功能的RNA。近年来研究显示，lncRNA具有各种不同的生物学功能，作为抑癌或致癌基因参与肿瘤的发生、发展。lncRNACCAT1被证实高表达于结肠癌、胃癌、胆囊癌，然而在肝细胞肝癌中的表达情况仍不清楚［2～4］。本研究中笔者采用荧光定量PCR法检测肝癌组织中lncRNACCAT1中的表达情况，并分析其与临床病理因素的相关性。
材料与方法
1．标本来源:
收集2005年9月～2010年10月在温州医科大学附属浙江省台州医院接受手术治疗的96例HCC患者的组织标本(包括癌灶组织及相应癌旁组织)，术后均确诊为肝细胞肝癌。肿瘤病理诊断参照世界卫生组织标准、临床分期标准参照美国癌症联合委员会(AJCC)制定的第7版TNM分期标准［5］。术前患者均未接受放化疗或其他任何药物干预。并有完整临床病理资料(年龄、性别、病理诊断、门静脉癌栓、酗酒、肿瘤直径、TMN分期等)。所有患者中位随访时间为38．5个月(2．0～60．0个月)，其中57例死于肝癌。为研究lncRNACCAT1的临床相关性，笔者根据CCAT1表达量将数据平均分为两组，即CCAT1高表达组和CCAT1低表达组，并对肝癌组织中lncRNACCAT1的表达量与各临床病理因素的关系进行分析。所有人体标本的研究均事先获得伦理委员会的批准。
2．实时定量聚合酶链反应(real－timePCR)检测肝癌及癌旁组织中lncRNACCAT1的表达:
采用Tr-izol试剂盒(美国Invitrogen公司，Carlsbad，CA)试剂盒抽提总RNA。采用ABI公司的HighCapacitycD-NAReverseTranscription试剂盒将RNA反转录合成cDNA，反转录反应:25℃10min，37℃120min，85℃5min，4℃保存。RT－PCR采用ABI公司PowerSYBRGreenPCRMastermix试剂盒及ABI7900HT系统，以GAPDH为内参基因，使用2－△△Ct法计算lncRNACCAT1在肝癌组织相对于癌旁组织的表达量，并根据其表达水平中位数将肝癌患者分为低表达组和高表达组，分析CCAT1表达与临床病理参数及预后的关系。引物序列如下:CCAT1上游引物:5'－GCCGTGTTAAGCATTGCGAA－3'，下游引物:5'－AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA－3';GAPDH上游引物:5'－GAAATCCCATCACCACTTCCAGG－3'，下游引物:5'－GAGCCCCAGCCTTCTCCATG－3'。
3．统计学方法:
实验结果应用SPSS20．0统计学软件进行统计分析。不同组间的差异评估采用Student'st－test或χ2检验，生存分析用Kaplan－Meier和Log－rank检验，多因素分析用COX回归模型，以P＜0．05为差异有统计学意义。
结果
1．lncRNACCAT1在肝癌癌灶及癌旁组织中的表达:qRT－PCR结果经Student'st－test检验提示肝癌组织中lncRNACCAT1较癌旁组织明显低表达(P=0．000)，见图1。图2．肝癌中lncRNACCAT1的表达量与临床病理因素的关系:lncRNACCAT1的表达量与门静脉癌栓(χ2=15．229，P＜0．05)及TNM分期(χ2=4．196，P=0．041)具有相关性，而与患者年龄、性别、肿瘤直径、酗酒等无明显相关(P＞0．05，表1)。
3．lncRNACCAT1与肝癌患者预后的关系:
对96例肝癌患者进行生存分析。Kaplan－Meier分析显示:HLA－F阳性患者术后平均生存时间为32．1个月(95%CI:26．3～38．0个月);HLA－F阴性患者术后平均生存时间为47．2个月(95%CI:42．5～52．0个月)。HLA－F阳性患者生存时间短于阴性患者，差异有统计学意义(χ2=7．607，P=0．006，图2)。COX回归模型分析肝癌患者预后影响因素，单因素分析显示:HLA－F表达、TNM分期均是肝癌患者术后生存时间的危险因素。多因素分析显示HLA－F更是影响肝癌患者术后生存的独立危险因素(表2)。
讨论
长链非编码RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一群长度＞200bp的RNA，不具有编码功能，以往认为其是RNA聚合酶Ⅱ的转录副产物，不具备生物学功能［6］。但是近些年来研究表明，lncRNA可以在转录、转录后等不同水平参与下游基因的调控，与肿瘤发生、发展密切相关［6～8］。其可能的作用机制:①按照碱基配对原则，参与mRNA前体修饰;②与蛋白质或miRNA结合，调控相关基因的表达;③招募染色质修饰酶复合物致目标基因区域，参与其表观遗传学修饰［9～11］。lncRNACCAT1是一个拥有2628bp的非编码RNA分子，最早在结肠癌中被发现，位于8q24．21、转录因子C－Myc附近，研究表明这是基因突变的高发区［12］。近年来已有研究显示CCAT1在胆管癌等肿瘤组织中高表达［13～15］，参与肿瘤恶性进展。Jiang等［13］研究发现CCAT1在胆管癌组织中的表达较癌旁组织高，其表达量与组织分化程度、淋巴结侵袭、TNM分期及患者预后相关，是胆管癌患者的独立预后因素。Zhang等［14］研究显示CCAT1可通过负调控miR－218－5P促进视网膜母细胞瘤SO－RB50及Y79细胞株的增殖、侵袭、迁徙、并减少凋亡，可作为视网膜母细胞瘤的潜在治疗靶点。研究发现，结肠癌患者中lncRNACCAT1和HOTAIR表达升高，有望成为结肠癌筛查指标，提高结肠癌阳性诊断率。笔者采用RT－PCR法分析了lncRNACCAT1肝癌组织中的表达情况，结果发现:①lncRNACCAT1在肝癌癌灶组织中表达升高;②其表达量与患者年龄、肿瘤直径、浆膜侵犯、TNM分期等无明显相关，而与门静脉癌栓和肿瘤数目表现出一定相关性;结合上述两点，笔者推测lncRNACCAT1高表达可能在肝癌恶性进展中发挥重要作用;③生存分析发现lncRNACCAT1表达阳性患者预后较差，可作为肝癌患者预后的独立危险因素。总之，笔者研究了lncRNACCAT1在肝癌组织中的表达特点和预后意义，推测lncRNACCAT1表达在肝癌发生、发展中发挥重要作用;并且lncRNACCAT1表达与预后相关，是肝癌患者的独立预后影响因素，对判断肝癌患者预后具有重要参考价值。但lncRNACCAT1在人体生理病理中其临床意义及作用机制等研究刚刚起步，仍需要进一步探索。
作者：陈思思陈霞蒋琼英徐永富朱昱胡鹏单位：温州医科大学附属浙江省台州医院口眼中心