葡萄球菌对乳杆菌抑菌活性的影响范文

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《畜牧兽医学报》2014年第八期

1材料和方法

1.1抑菌圈试验杯蝶法杯蝶法一般采用双层琼脂平板为指示菌平板，底层加入15mL2%的融化素琼脂。待底层冷却后，放入数个外径为6mm的牛津杯，取1mL一定浓度指示菌菌悬液加入到15mL冷却至45℃左右的琼脂浓度为1%的培养基中，迅速混匀，倾倒到素琼脂之上，冷却后用无菌镊子将牛津杯取出，即形成若干孔洞，分别向内注入200μL发酵上清液，37℃温育24h，观察孔洞周围抑菌圈大小，并且用游标卡尺测定透明圈直径。

1.2混合培养菌中L.acidophilus的胞外乳酸含量的测定将待测菌液去除菌体保留上清液，采用高效液相色谱仪检测其乳酸含量。

1.3混合培养菌中L.acidophilus的乳酸脱氢酶活力的测定取上清液采用WFH-201BJ分光光度计测定，参数设置依据试剂盒说明书。

1.4混合培养菌中L.acidophilus的glyA和ldh基因表达的检测根据L.acidophilus在NCBI的GenBank中登录的L.acidophilus序列(NC_006814)，设计引物，通过real-timePCR方法检测glyA基因(5''''-GAAGATTTACAGCCACAG-3''''/5''''-TGCCACCAGATACTACAC-3'''')和ldh(5''''-GTAGCCTTTTCCATTTGC-3''''/5''''-TCGCTTGGTCCACTGTTC-3'''')。

2结果

2.1L.acidophilus与S.aureus混合培养的生长曲线变化在生长到对数生长期的L.acidophilus培养物中加入1%的S.aureus后共同培养24h时，L.aci-dophilus菌数达最大值；而加入10%S.aureus时，L.acidophilus菌数变化与L.acidophilus对照组不显著。表明加入1%S.aureus对L.acidophilus菌数的增殖促进作用明显。在整个培养过程中，未处理组与1%混合培养组变化不大，表明加入1%S.aureus对L.acidophilus的增殖无影响，而在加入10%接种量时，L.acidophilus菌数有较明显下降，并且对其增长曲线影响较大。

2.2L.acidophilus与S.aureus混合培养上清液抑菌圈直径变化随着培养时间增加，3个实验组抑菌圈直径均逐渐加大，培养到12h时，加入1%S.aureus组抑菌圈直径增加最明显，之后，随着培养时间的增加抑菌圈直径变化不大。实验结果表明，加入1%S.aureus后的L.acidophilus在培养到12h时，抑菌作用最显著。

2.3L.acidophilus与S.aureus混合培养上清液中乳酸含量的变化生长至对数期的L.acidophilus加入不同接种量的S.aureus再培养的过程中，L.aci-dophilus产乳酸随混合菌液培养时间增长含量增加，但由培养时间6h～12h时增加明显，在12h～36h过程中增加较为缓慢(图3)，表明在12h时是L.aci-dophilus代谢最旺盛时期。

2.4L.acidophilus与S.aureus混合培养上清液中乳酸脱氢酶活力变化L.acidophilus与S.aureus混合菌液从6h～12h培养过程中乳酸脱氢酶活力显著增加，但从12h～24h过程中活力平稳并且逐渐下降，从24h～36h过程中，活力下降明显。S.aureus接种量为1%和10%的两种不同菌液变化趋势相同，但接种量10%比接种量为1%的乳酸脱氢酶活力较小(图4)。表明S.aureus接种于L.acidophilus量不同，其对L.acidophilus乳酸脱氢酶活力的影响也不同，但总体变化趋势一致。

2.5混合培养中L.acidophilus的glyA和ldh基因表达的检测生长到对数生长期的L.acidophilus加入1%S.aureus共培养12h时，L.acidophilusglya基因表达量达到峰值，随后下降明显，至24h达最低值。glyA基因在未处理组及接种量为10%的试验组中表达量不明显，而在接种1%S.aureus时共培养12h时却明显增加，表明接种量1%的S.aureus对L.acidophilusglyA基因的表达量有明显的促进作用；L.acidophilusldh基因表达量达到峰值，而加入10%S.aureus共培养时，L.acidophilusldh基因表达量变化不明显(图5)。试验表明，L.acidophilus在接种1%S.aureus培养12h，ldh基因表达量增加最多，表明接种1%S.aureus时对L.acidophilusldh基因表达量影响最大。

3讨论

L.acidophilus是一种常见的益生菌[5]，近几年对其在食品、医学、农业中的影响研究较多，因L.acidophilus对耐药性的S.aureus具有较好的抑菌效果而受到重视，尤其是饲喂后对动物的免疫力的提高作用显著。其代谢产生的乳酸，是一种重要抑菌因子，可透化细菌外膜，从而抑制或杀死金黄色葡萄球菌。但有关L.acidophilus添加不同比例的S.au-reus混合培养后其生理变化，尤其是有关产抗菌肽特性变化的研究较少。L.acidophilus虽有较强的蛋白质分解能力,但自身产酸速率较慢，本实验加入不同接种量的S.aureus对其产乳酸以及乳酸脱氢酶活力的增加都有较强的促进作用。ldh基因和glyA基因都是L.acidophilus代谢调控的关键酶基因：ldh基因编码的乳酸脱氢酶能利用丙酮酸生成乳酸；苏氨酸在glyA基因编码的苏氨酸醛缩酶的催化作用下能够生成乙醛。本实验中L.acidophilusglyA基因及ldh基因可能对加入一定量的S.aureus较为敏感，当加入S.aureus达到一定量时除了能够促进其抗菌肽的产出量外，对产酸及其它生理特性都有很大的促进作用。综合本实验结果表明，加入1%的S.aureus和L.acidophilus混合培养12h时L.aci-dophilus的各项生理生化指标增加最显著，此时，L.acidophilus产抗菌肽活性最强。本实验对L.aci-dophilus产抗菌肽的抗菌机理的研究，具有一定的理论指导意义。

作者：刘营于微孙吉吉张明辉高学军敖金霞单位：东北农业大学农业生物功能基因重点实验室东北农业大学生命科学与生物技术研究中心乳品科学教育部重点实验室