仔猪散发亚临床猪瘟的抗体效价范文

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《现代畜牧兽医杂志》2014年第七期

1方法

1.1CSFV的检测取采集的仔猪脾脏和淋巴结组织约1g于研磨器充分研磨，用Hanks液1:5稀释，反复冻融3次，8000r/min离心10min，取上清液400μL，加入800μLTrizol，混匀后室温放置5min。加入200μL氯仿，旋涡振荡15s混匀，室温下放置2～3min，12000r/min离心10min。取上清转移到新的EP管，再加入500μL异丙醇混匀，室温下放置10min。12000r/min离心10min，弃上清，再加入75%酒精1000μL，旋涡振荡混匀，12000r/min离心5min，晾干，用适量无RNzse水溶解RNA。然后取提取的RNA10μL，Primer（P2下游）1μL，70℃5min，置于冰上2min，加入5×RTBuffer4μL，10mmol/LdNTPMixture2μL，40U/μLRNaseInhibitor1μL，混匀，37℃5min，加入5U/μLAMVRe-verseTranscriptaseXL1μL42℃2.5h，70℃10min放于冰上待用。将合成的cDNA（CSFV）作为模板，进行PCR扩增。反应体系为25μL，其中10×Taq酶Buffer（Mg2+）2.5μL，MgCl2+5U/μLTaq酶1μL，2.5mmoL/LdNTP2μL，10μmol/L的P1P2上下游引物各1μL，CSFV的CDNA5μL，H2O3μL。混匀后置于PCR仪中扩增。反应程序为：94℃预变性5min，进行30循环（94℃30s、50℃40s、72℃1min），72℃延伸10min，最后降温至4℃结束。取PCR产物与10×DNA样缓冲液混合，在1%琼脂糖凝胶上电泳20min，用溴化乙锭染色，50V电压电泳1h左右后，在紫外检测仪下观察电泳结果。

1.2CSFV阳性重组子的鉴定与测序使用小量胶回收试剂盒（上海华瞬生物工程有限公司）进行。取纯化的DNA样品，进行电泳，观察其纯度。然后与pMD18-T载体进行连接，连接反应总体积10μL，16℃连接过夜；反应完毕后，全量转化TG1感受态细胞。涂布于含有IPTG、Xgal和Amp+LB的琼脂平板，37℃培养过夜。挑取单菌落于5mL含Amp+的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，按《分子克隆实验指南》的碱裂解法小剂量制备质粒的步骤进行阳性质粒提取。根据Primer5.0软件对CSFV基因的cDNA参考序列和pMD18-T载体的质粒图谱用Hin-dIII、BamHI进行重组质粒的酶切鉴定。用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。再用PCR鉴定CSFV阳性重组子，将鉴定正确的阳性重组子送大连宝生物工程公司测序。

1.3血清抗体的检测用血清稀释液对阳性和阴性标准血清做1:20稀释，每孔50μL，阴、阳性标准血清各做2孔；待检血清样品用血清稀释液做1:20稀释，同时设2孔不加任何血清样品的空白对照孔。密封，37℃结合45min。洗板：弃去孔内液体，然后将25倍洗涤液用灭菌水或超纯水稀释成1倍工作液，每孔加入220～300μL洗板，反复4次，最后一次弃净孔内液体。加入酶标二抗：浓缩酶标记抗体用血清稀释液做1:100稀释，每孔加入50μL，密封，37℃结合45min（注意：从加入第一孔时开始计时间）。重复洗板步骤。加入底物：将底物A和B作1:50体积混匀，每孔加入50μL，轻轻震荡混匀，密封。37℃避光作用15min。加样的顺序应同加入酶标二抗保持一致，从加入第一孔时开始计时间。终止反应：每孔加入50μL终止液，轻摇混匀，测定吸光度OD490nm。

2结果与分析

2.1CSFV的检测结果由图1可见，用RT-PCR方法，以逆转录合成的的cDNA为模板，用引物P1、P2扩增出约288bp的目的片段，与预计的理论值相符。表明发病猪场的病猪的病原为猪瘟病毒。

2.2CSFV序列测定及同源性比较结果见图2。分离株与GenBank中发表的同源毒株序列进行比较，其核苷酸同源性为89.41%。从进化树的关系上看引起发病的病毒与32在同一聚类上。3.3血清抗体检测结果结果判定：根据OD490值计算P/N值（阳性血清OD940值/阴性血清OD490值，其中P为标准阳性血清的OD490，N为2孔标准阴性血清的平均OD490）。当P/N值≥5，表示试验成立，然后根据S/N值对待检血清进行判定（S为待检血清的OD490值），阴性为S/N≤1.5，可疑为1.5≤S/N≤2，阳性为S/N＞2，抗体保护临界值为S/N≥2.5。在散养猪场所采60份母猪血清中，S/N≥2.5的有2孔，占3.3%，2≤S/N≤2.5的为0，1.5≤S/N≤2的有6孔，占10%，S/N≤1.5的有40孔，占80%。据判定标准和S/N值计算结果表明，被检测的60头仔猪免疫都没有达到抗体保护临界值，阳性反应的仅占3.3%，说明猪瘟免疫失败。

3讨论

本研究表明，黑龙江省某养猪户仔猪散发病死亡的病原为猪瘟病毒。抗体检测结果显示，猪瘟抗体保护率仅为3.3%，母猪的免疫效果差，使得仔猪不能从母乳中获得充足的母源抗体达到防控猪瘟的目的。在饲养管理不佳、环境污染严重、应激等情况下仔猪易感染野毒引发亚临床猪瘟[4]。该养猪户采用一般的春秋两季免疫猪瘟疫苗。春秋两季正是春种和秋收最忙的季节，因农户家经常没人，从而未能及时接种猪瘟疫苗，致使统一免疫免疫密度不能得到完全的保证，另一方面疫苗对温度的要求也较高，农村条件有限，稀释以后的疫苗如不能及时接种，保存不当会存在失效的可能。

这些因素可能都直接或间接地导致了猪瘟免疫合格率低，母猪易成为隐性感染者。该养猪户种母猪带毒会产出免疫系统不健全或持续感染的仔猪，引起仔猪发生亚临床猪瘟。或者仔猪摄入母源抗体少，抗体消失早，也易感染猪瘟病毒，进而形成了疾病的传播链。因此，在猪瘟的控制过程中，保证种猪有一个较高的稳定的猪瘟抗体水平具有至关重要的作用；同时，淘汰隐性感染的母猪，减少仔猪感染的机会。配合新生仔猪的超前免疫，并加强消毒、隔离等预防措施，可以保证仔猪健康。

作者：吴凌白云龙冉旭华夏成邵红单位：黑龙江省八一农垦大学动物科技学院