苜蓿多糖的免疫效果范文

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《现代畜牧兽医杂志》2014年第七期

1材料

1.1试验动物1日龄海兰雏鸡由辽宁医学院畜牧兽医学院种鸡场提供。

1.2试剂鸡新城疫HI阳性抗原购自中国兽医药品监察所；肝素钠购自北京双鹤药业股份有限公司；台盼蓝（TrypanBlue）和四甲基偶氮唑盐（MTT）均购自美国Sigma公司；RPMI-l640细胞培养液购自美国Gibco公司；新生牛血清（NBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Percoll细胞分层液购自Pharmacia公司；二甲基亚砜（DM-SO）购自Sigma公司；苜蓿多糖由实验室提取。

1.3疫苗LaSota株购自哈药集团生物疫苗有限公司，批号201401。

2方法

2.1苜蓿多糖的提取

2.1.1苜蓿多糖的提取工艺采集实验室种植的头茬现蕾期紫花苜蓿茎叶部分，按常规制成风干样后，经粉碎制成草粉，过40目筛处理。取苜蓿草粉与蒸馏水按1:25比例混合，放入95℃的水浴锅中进行浸提2h，浸提次数为2次；抽滤，重复1次；放入水浴锅中蒸发至溶液为1/3时，加2倍体积的95%乙醇溶液，充分振荡，放置6h，4000r/min离心10min，得沉淀，热水溶解，重复2次得粗多糖。苜蓿多糖粗品中含有较多的蛋白质，为进一步纯化多糖粗品需经脱蛋白处理，常用Sevag法除蛋白质。氯仿-正丁醇溶液（5:1），粗多糖样品：混合液为1:1体积比例加入，放置于分液漏斗中振荡分离，分出上层糖液层，重复上述操作3次，得到纯化多糖溶液备用[9-11]。

2.1.2苜蓿多糖的配制苜蓿多糖配制时均用DMSO（终体积＜0.1%）助溶，称取纯化多糖溶液2mg，加8μLDMSO溶解，再加入3992μLRPMI-1640混匀，配成浓度500mg/L的原液；最后均用0.22μm滤膜过滤除菌，每EP管350μL分装，-20℃保存备用。

2.2雏鸡分组及处理选择1日龄海兰雏鸡120羽随机分为4组，每组30羽，7日龄每羽用LaSota株滴鼻、点眼，0.05mL/羽，28日龄以相同剂量和方法进行加强免疫。3个试验组从7日龄开始分别肌肉注射低、中、高剂量（10、25、50μg/mL）的苜蓿多糖，对照组注射生理盐水，1次/d，连用7d。

2.3样品的采集在第14、21、28、35、42、49、56日龄，通过静脉采集抗凝血及无抗凝血，其中抗凝血用于淋巴细胞吸光度值的检测，无抗凝血取血清用于新城疫病毒血凝抑制（HI）抗体效价的检测。

2.4雏鸡外周血淋巴细胞吸光度值的检测

2.4.1雏鸡外周血淋巴细胞悬液的制备雏鸡翅下静脉采血2mL加入抗凝管，用肝素抗凝，混匀，5min后加入RPMI-1640液2mL，混匀。将抗凝血全部缓慢加至含2mL淋巴细胞分层液管的液面上，注意保持2种液体界面清晰。将试管平衡后置水平式离心机，2000r/min离心20min。此时离心管中形成5层：由上至下的顺序分别为血浆、PBMC、淋巴细胞、粒细胞和红细胞。用毛细吸管仔细吸取淋巴细胞放入离心管内至1刻度处。加入5倍体积的RPMI-1640液，混匀，5000r/min离心10min，用PBS洗涤细胞2次，末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI-1640，重悬细胞[12]。

2.4.2淋巴细胞计数将淋巴细胞悬液混匀，吸取10μL加入到40μL含10%灭活小牛血清的RPMI-1640液中，混匀后再吸取10μL加入到血细胞计数板上。取盖玻片轻轻覆盖于标本上，静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。具体计数方法：计算血细胞计数板上四个角的四个大方格中淋巴细胞总数。按下列公式求出单个核细胞总数：单个核细胞总数=四个大方格中单个核细胞总数/4×稀释倍数×细胞悬液毫升数。

2.4.3细胞存活率检测取10μL淋巴细胞悬液加入0.2%台盼蓝染色液10μL，混匀。取10μL加入血细胞计数板，静置片刻，置显微镜高倍镜下观察。结果判定：活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入细胞内，故死细胞被染成蓝色，死细胞体积较大，无光泽。正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。计数200个细胞中的死亡细胞数并计算其存活率。细胞存活率=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。

2.4.4外周血淋巴细胞吸光度值的检测采用MTT法检测外周血淋巴细胞吸光度值（OD值）[13]。将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100μL，每组均设4复孔。然后每孔分别加入100μLRPMI-l640细胞培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中连续培养44h；取出培养板，每孔加入20μLMTT液，继续培养4h；于2000×g离心10min弃上清，每孔加入150μLDMSO，振荡10min至形成的紫色结晶完全溶解，放入培养箱中裂解12h后取出，酶标仪在570nm波长处测OD值。

2.5血清ND-HI抗体效价测定用微量法检测新城疫病毒血凝抑制（HI）抗体效价。

2.6数据统计分析采用SPSS13.0软件统计，数据以X±SD表示，采用方差分析分析各组之间的差异显著性。

3结果

3.1苜蓿多糖对雏鸡外周血淋巴细胞OD值的影响雏鸡外周血淋巴细胞OD值见图1。由图1可知，低、中、高剂量组与对照组比较：第14、21、28、35、42日龄，低、中、高剂量组与对照组比较差异均极显著（P＜0.01）；第56天，低剂量组与对照组比较差异不显著（P＞0.05），中、高剂量组与对照组比较差异均极显著（P＜0.01）。低、中、高剂量组之间比较：第14日龄，低、中剂量组比较差异不显著（P＞0.05），低、中剂量组与高剂量组比较差异均极显著（P＜0.01）。第21、28、35、42日龄，低、高剂量组比较差异不显著（P＞0.05），低、高剂量组与中剂量组比较差异均极显著（P＜0.01）。第14日龄，低、中剂量组比较差异显著（P＜0.05），低、中剂量组与高剂量组比较差异均极显著（P＜0.01）。

3.2苜蓿多糖对雏鸡ND-HI抗体效价的影响雏鸡ND-HI抗体效价见图2。由图2可知，低、中、高剂量组与对照组比较：第14日龄，低、高剂量组与对照组比较差异均显著（P＜0.05）；中剂量组与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。第21、28、35、42、56日龄，低、中、高剂量组与对照组比较差异均极显著（P＜0.01）。低、中、高剂量组之间比较：第14、28、35、56日龄，低、中、高剂量组比较差异均不显著（P＞0.05）。第21日龄，低、高剂量组比较差异不显著（P＞0.05），低、高剂量组与中剂量组比较差异均显著（P＜0.05）。第42日龄，低、高剂量组比较差异不显著（P＞0.05），低、中剂量组比较差异显著（P＜0.05），中、高剂量组比较差异极显著（P＜0.01）。

4讨论

植物多糖的免疫调节作用目前得到比较普遍的认可。灵芝多糖能提高血清溶血素含量，促进小鼠迟发型变态反应，提高小鼠碳廓清能力，提高小鼠NK细胞活性，提高小鼠胸腺指数；芦荟多糖可以增加健康雏鸡的增重，促进免疫器官胸腺、脾脏和法氏囊的发育，特别是胸腺的发育，对血清IFN-γ和血清IL-2具有一定的诱生能力，芦荟多糖可以明显增加免疫抑制雏鸡的增重，能促进血清IL-2和IFN-γ的诱生，提高机体的抵抗力，提高ND抗体水平；芦荟多糖可阻止胸腺淋巴细胞的衰老性减少，抑制胸腺组织的脂肪化；枸杞多糖能明显提高健康小鼠脾脏生成抗体细胞数、半数溶血值及巨噬细胞吞噬功能；枸杞多糖可延缓荷瘤小鼠的成瘤期，延长生存期，提高胸腺指数、脾指数，使骨髓树突状细胞CD86、CD11a、IL-12P40的表达升高，树突状细胞致敏的T淋巴细胞杀伤活性增强；硫酸化香菇多糖能显著提高血清中ND-HI抗体效价和外周血T细胞的转化；淫羊藿多糖作为免疫佐剂均可促进抗体的产生，提高脾脏指数；当归总多糖能显著促进脾细胞的增殖，中剂量组能显著促进混合淋巴细胞和T细胞的增殖反应，显著增加培养的脾细胞中CD4+T细胞亚群的比率；黄芪多糖可以增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率，并且使吞噬指数提高，亦能促进正常小鼠胸腺和脾脏重量的增加，还可使红细胞、白细胞、淋巴细胞数量增加；硫酸化黄芪多糖、硫酸化淫羊藿多糖、硫酸化香菇多糖、硫酸化当归多糖和硫酸化枸杞多糖均可单独或协同ConA刺激淋巴细胞增殖，且有一定的量效关系。本研究结果，苜蓿多糖能够显著提高外周血淋巴细胞OD值，显著提高血清中新城疫病毒HI抗体效价，表明苜蓿多糖具有免疫调节作用。苜蓿多糖是从紫花苜蓿中提取的植物多糖，是苜蓿的主要生物活性成分。苜蓿是非常优质的多年生豆科牧草，在中国有悠久的栽培历史。苜蓿中干物质可达10%～15%，苜蓿草产量高、适口性好、营养丰富、易于家畜消化，有“牧草之王”之称。苜蓿中可利用蛋白含量高，营养价值好。苜蓿也是传统的中药，具有清热解毒、凉血通淋、益气健脾、温肾等功效，决定着苜蓿及其制剂开发和临床应用具有广阔的前景。

5结论

苜蓿多糖配合鸡新城疫活疫苗的使用，能显著提高外周血淋巴细胞OD值，能够显著提高血清中新城疫病毒HI抗体效价，表明苜蓿多糖可作为鸡新城疫活疫苗的免疫佐剂。

作者：张月房琳琳赵亚男于洋李敬双单位：辽宁医学院