痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应范文

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《实用医学杂志》2015年第二十期

痤疮是皮肤科常见炎症性疾病。痤疮丙酸杆菌是痤疮发病的重要因素，其过量繁殖可导致毛囊壁炎症，伴随大量单核细胞浸润；痤疮丙酸杆菌可刺激单核细胞分泌多种炎症因子，从而加重皮肤炎症。以上研究提示调控痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应是治疗痤疮的关键环节。目前临床常采用激素或抗生素治疗痤疮，但副作用较多且易产生耐药性。因此，采用天然药物来治疗痤疮具有重大临床治疗意义。姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的物质，具有抗氧化、抗炎等多种生物学功能，但其对痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应的影响及机制尚不清楚。本研究旨在探讨姜黄素对痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞炎症反应的影响及作用机制，以期为姜黄素临床干预治疗痤疮提供实验依据。

1材料与方法

1．1材料痤疮丙酸杆菌由中科院上海健康科学研究所张雁云教授惠赠；姜黄素购自Sigma-Aldrich公司；THP-1细胞株由本室保存；TNF-α和IL-8ELISA试剂盒购自R＆D公司；CCK8试剂盒购于Dojindo；TLR2抗体购自Abcam公司；NF-κBp65抗体购自SantaCruz公司；P-NF-κBp65抗体购自CellSignal公司；β-actin抗体购自碧云天公司；实时荧光定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。

1．2方法

1．2．1实验分组与细胞培养设空白对照组、痤疮丙酸杆菌组及痤疮丙酸杆菌＋姜黄素组（5、10、15μmol／L），共5组。THP-1细胞接种于6孔板，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，调整细胞浓度为1×106／mL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。

1．2．2CCK8法检测细胞活力将THP-1细胞接种于96孔板，调整细胞浓度为10000细胞／孔，加入不同浓度的姜黄素培养4h，进而加入痤疮丙酸杆菌（15μg／mL）培养8h后，采用CCK8法检测细胞活力，于450nm处测定光吸收值。设空白对照组细胞活力为100％。

1．2．3ELISA法检测细胞因子表达THP-1细胞接种于6孔板，调整细胞浓度为1×106／mL，加入不同浓度姜黄素培养4h，进而加入痤疮丙酸杆菌培养8h，采用ELISA试剂盒，按说明检测细胞培养上清中TNF-α和IL-8含量。

1．2．4实时荧光定量PCR检测TRIzol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。引物序列如下：TLR2正向引物：5-ATCCTCCAATCAGGCTTCTCT-3，反向引物：5-GGACAGGTCAAGGCTTTTTACA-3；NF-κBp65正向引物：5-ATGTGGAGATCATTGAGCAGC-3，反向引物：5-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3；GAPDH正向引物：5-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3，反向引物：5-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3。GAPDH为内参，比较循环阈值法（2-△△Ct）分析基因相对含量。

1．2．5Westernblot检测裂解细胞提取蛋白，蛋白电泳后按常规方法转移至PVDF膜上，分别加入抗TLR2、NF-κBp65、P-NF-κBp65及β-actin抗体。4℃孵育过夜后，经HRP标记的二抗室温孵育1h，按ECL试剂盒说明书进行曝光、显色。

1．2．6统计学处理应用SPSS13．0软件进行统计处理，计量资料以均值±标准误表示，应用单因素方差分析，P＜0．05为差异有显著性。

2结果

2．1姜黄素对细胞活力的影响姜黄素在5~15μmol／L的浓度范围内，与THP-1细胞共培养12h后，对细胞的活力无明显影响（图1A）；当处理时间延长至24h后，姜黄素明显抑制了THP-1细胞活力，提示姜黄素的给药时间在12h内为宜（图1B）。进一步分析姜黄素对痤疮丙酸杆菌处理后细胞活力的影响，发现与未处理组相比，痤疮丙酸杆菌能明显抑制THP-1细胞活力（P＜0．05）；然而与单纯痤疮丙酸杆菌处理组相比，姜黄素对THP-1细胞活力无明显影响。

2．2姜黄素对炎症因子表达的影响ELISA法检测培养上清发现，痤疮丙酸杆菌能促进THP-1细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-8，姜黄素在10μmol／L与15μmol／L浓度时能明显抑制痤疮丙酸杆菌诱导的TNF-α和IL-8分泌（P＜0．05），尤其在15μmol／L浓度时抑制效果尤为明显。

2．3姜黄素对TLR2表达的影响痤疮丙酸杆菌刺激后，THP-1细胞TLR2基因表达升高。与单纯痤疮丙酸杆菌刺激组相比，姜黄素给药明显抑制了TLR2基因的表达（P＜0．05，图3A）。Westernblot进一步证明姜黄素能有效降低痤疮丙酸杆菌诱导的TLR2表达（图3B）。

2．4姜黄素对NF-κBp65表达的影响实时定量PCR与Westernblot分析显示，痤疮丙酸杆菌刺激后，THP-1细胞NF-κBp65表达明显升高；与单纯痤疮丙酸杆菌刺激组相比，姜黄素给药明显抑制了THP-1细胞NF-κBp65和P-NF-κBp65的表达（图4）。

3讨论

痤疮常采用抗生素治疗，但长期使用能产生抗生素耐药性。为避免抗生素耐药性的产生，采用天然物质来治疗痤疮受到广泛关注。姜黄素是从植物姜黄中提取的天然物质，具有强大的抗炎作用，然而其治疗痤疮的效果尚不清楚。姜黄素能通过抑制单核细胞活化来缓解多种炎症性疾病。本研究发现姜黄素能抑制痤疮丙酸杆菌诱导的TNF-α和IL-8分泌。TNF-α和IL-8是痤疮炎症反应中的重要炎症因子，这些结果提示姜黄素可能通过抑制痤疮丙酸杆菌引起的炎症反应来缓解痤疮的发病。

痤疮丙酸杆菌主要通过模式识别受体TLR来活化单核巨噬细胞。研究发现TLR2在痤疮的发病过程中有重要作用，痤疮患者TLR2的表达明显增高。敲除TLR2基因的小鼠接受痤疮丙酸杆菌刺激后不能产生IL-6，而敲除其他TLR基因的小鼠接受痤疮丙酸杆菌刺激后仍能产生大量IL-6。本研究发现，痤疮丙酸杆菌能明显上调THP-1细胞TLR2的表达，姜黄素则抑制了痤疮丙酸杆菌诱导的TLR2表达。提示姜黄素可能是通过降低TLR2表达来抑制单核细胞活化，导致单核细胞炎症因子分泌减少而缓解痤疮的炎症反应。TLR识别相应配体后，主要通过MyD88途径活化下游核因子NF-κB。本研究发现姜黄素能抑制痤疮丙酸杆菌诱导的NF-κB表达，提示姜黄素可能是通过TLR2相关信号通路来调控痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应。

本研究在体外发现姜黄素能明显抑制痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应，其治疗作用尚需体内实验证实，下游信号通路也有待进一步的研究。本研究结果将为姜黄素临床治疗痤疮提供实验基础和理论依据。

作者：顾巧丽 蔡燕 杨惠林 施勤 单位：苏州大学附属第一医院