海洋生物源肝素的研究进程范文

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《生物医学工程研究》2018年第2期

摘要：【目的】为海洋生物源肝素的研究提供参考依据，促进海洋生物资源的综合利用。【方法】对海洋生物源肝素的提取技术、分离纯化技术、结构鉴定、生物活性进行了归纳总结。【结果】海洋生物源肝素作为传统肝素的替代原料，具有副作用小、与人体细胞兼容性好的特点，但其提取率不如陆地生物源肝素高，且对其活性机制的研究还不够透彻，未能掌握肝素特异结构与活性间的关系。【结论】为充分开发海洋生物源肝素，未来的研究重点应该包括改进海洋生物源肝素的制备和合成、开发改进性能的肝素抗凝剂、开发新的生物活性以及相应的药物或保健品、更新肝素原料库。

关键词：肝素；海洋生物；分离纯化；结构分析；生物活性

肝素因在肝脏中发现而得名，是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸IdoA和D-葡萄糖醛酸GlcA)和氨基己糖(ɑ-D-葡糖胺，GlcN)及其衍生物（乙酰化、硫酸化）所组成的一种糖胺聚糖，其中硫酸基和羧基含量很高，是已知负电荷密度最高的生物大分子[1]。此外，研究表明，肝素是一种广泛用于临床的天然多糖类抗凝血活性物质，具有抗凝血、抗炎、抗血管生成、抗病毒等生物活性[2]，临床上常用于防治血栓栓塞性疾病、弥散性血管内凝血和心肌梗塞的治疗。一般而言，肝素来源于猪、牛、羊的小肠黏膜提取物，也存在于动物的血管壁和肺之中，但由于受到肝素污染事件、疯牛病和宗教信仰的影响，陆地哺乳动物源肝素的开发受到限制，有学者提出从相对洁净的海洋生物中寻找肝素新资源以替代陆地动物原料。海洋占地球表面积70%以上，庞大的生物库及其独特的环境，造就了丰富的生物资源。近年来，从海洋生物中寻找肝素来源的替代原料的研究日益增多，已有报道从海湾扇贝、多种海藻和海洋细菌、虾、红树林蟹、金枪鱼、青口、和文蛤等多种海洋生物中提取出来肝素[3-8]。因此，本文综述海洋生物中肝素的提取纯化技术及生物活性等方面的研究进展，旨在为海洋生物源肝素的进一步开发与利用提供参考。

1海洋生物源肝素的提取

肝素的提取过程中，主要解决的技术难题是如何在不破坏肝素理化性质、结构特征和生物活性的情况下，断开肝素与蛋白质共价结合形成的糖肽键，从而有效去除蛋白质以及其他杂质。目前对海洋生物肝素的提取主要有碱性盐水提取法、超声波提取法和酶解提取法。

1.1碱性盐水提取法

碱溶液能使肝素与蛋白质之间的糖肽键断裂，从而将肝素从肝素-蛋白质复合物中提取出来，然后利用蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度降低而沉淀，以达到去除蛋白质的目的。该方法操作简单，成本低廉，但并不能完全去除蛋白质。Seedevi等[9]以硫酸钠为盐析剂，在pH为11.5，温度为55℃条件下进行热水浸提，以硫酸铝为凝结剂除去蛋白质，并通过十六烷基氯化吡啶（CPC)络合沉淀，从乌贼中提取出具有抗凝活性的硫酸粘多糖。Arumugam等[7]同样用该方法从青口和长砗磲中提取出肝素粗品，含量分别为2.2g/kg和2.72g/kg。

1.2超声波提取法

超声波提取法是一种物理破碎的过程，利用机械振动、热效应和空化作用对细胞组织进行破碎，以提高肝素在提取液中的溶解度和浸出率。作为海洋生物中肝素的新型提取方法，与传统提取方法相比，具有不需加热、提取率高、提取时间短、对生物活性的影响小和溶剂用量少等特点[10]。但是由于具有较强机械剪切作用，对目标物的物理结构易造成破坏作用，所以超声处理时间不宜太长。Fidelis等[11]采用了5种方法提取红藻中的硫酸多糖，结果表明，在碱性条件下，超声波结合酶水解法提取的硫酸多糖的抗凝血活性和抗氧化活性最佳。

1.3酶解提取法

酶解法是提取肝素常用的方法之一，蛋白酶能够破坏肝素与蛋白质共价结合的糖肽键，从而将肝素从肝素-蛋白复合物中分离出来，也可将杂蛋白分解为小分子肽。最后通过调节pH，热变性和盐析除去酶蛋白和被降解的蛋白质制得肝素[12]。为了蛋白质更好的水解，常选用广谱型蛋白酶，例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶等。酶解法操作简单，对目标物影响小，同时简化了后续脱蛋白的工艺，但对实验稳定性要求较高。刘斌等[13]采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶双酶法对原料进行水解,在强肋锥螺和海湾扇贝中发现少量肝素。Ticar等[14]在不同酶解条件下从方斑狮子鱼卵中提取出肝素类抗凝多糖，最佳条件下肝素提取率达到2.1％。Luppi等[15]采用木瓜蛋白酶对一种海洋双壳类软体动物CallistaChione进行酶解，制备得到一种高抗凝活性的肝素。

2海洋生物源肝素的分离、纯化

经提取后的粗品肝素除含有肝素外，还有其他种类的糖胺聚糖以及未除净的蛋白质和核酸等杂质。纯化目的就是要将这些杂质除去以得到高品质的肝素。目前海洋生物中肝素的纯化主要有有机溶剂沉淀法、季铵盐沉淀法、柱层析等方法。2.1有机溶剂沉淀法糖胺聚糖是一类水溶性物质，不溶于乙醇、丙酮等有机溶液，且不同糖胺聚糖在同一有机溶液中的溶解度是不同的，海洋生物肝素的纯化常利用这一特性将肝素与其他糖胺聚糖分离开来。有机溶液沉淀法是纯化生物大分子物质较为常用的方法，该方法不仅成本低，且操作简便有效，但往往会造成交叉沉淀，常用分步沉淀来提高产品质量。Andrade等[5]采用LEWATIT离子交换树脂层析和60％的丙酮沉淀的方法，从红树林蟹中提取出肝素。Dietrich等[15]以0.5、0.6、0.7和1倍体积的丙酮对巴西对虾提取物进行分级沉淀，在0.5和0.6倍丙酮沉淀的组分中提取出了650mg肝素。

2.2季铵盐沉淀法

季铵盐是一类阳离子表面活化剂，肝素是聚阴离子糖胺聚糖，能与各种阳离子反应生成盐。十六烷基三甲基化铵（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）与肝素反应生成络合物，当溶液盐浓度低于临界盐浓度时，络合物沉淀不溶解，当溶液盐浓度高于临界盐浓度，络合物将解离并溶解，而临界盐浓度则取决于聚阴离子的电荷密度和酸根（硫酸基和羧基）解离度[16]。孙晓明[17]用CTAB沉淀法进行二次沉淀，得到抗凝活性较低的粘多糖。Saravanan[18]用CPC沉淀法对海洋软体动物Amussiumpleuronectus提取物进行纯化，得到一种低分子肝素(LMWH)。

2.3柱层析法

柱层析法是肝素提纯中最为常用且有效的方法之一，主要有离子交换层析法和凝胶层析法。离子交换层析的原理是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的某种离子发生相互交换和竞争结合的反应来分离混合物。用于纯化肝素的离子交换剂有AmberliteIRA120/900、DEAE-Cellulose、SephadexA-25和D254树脂等阴离子交换树脂，目前国内常用D254树脂，该树脂对肝素钠的选择性较好，且成本低[1]。凝胶柱层析中的固定相是具有三维网状结构的多孔性凝胶，混合溶液流经凝胶时，小分子物质易流进凝胶，大分子物质不进入凝胶，洗脱时相对分子量大的物质先流出，分子量小的物质后流出，以此来分离不同相对分子量的物质。目前的凝胶主要有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖-琼脂糖混合凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等[19]。凝胶柱层析法不仅分辨率高，能将性质相近的组分分离，而且回收率高，分离条件缓和。不过分离操作一般较慢[20]。Chavavte等[21]从凡纳滨对虾虾头中提取出具有抗炎活性的肝素，并用DEAE-Sephacel离子交换层析法和SephadexG-25凝胶层析法进行纯化，纯化后的虾头肝素效价为51U/mg。Cesaretti等[22]用SephadexA-25离子交换层析对海蛤肝素粗品进行纯化，通过梯度洗脱得到单一组分，经琼脂凝胶电泳分析显示除肝素外仅有少量硫酸软骨素存在，说明纯化效果好。Flengsrud等[23]以抗凝血酶偶联琼脂糖为固相吸附剂进行亲和层析，从蛙鱼中分离出了高亲和力肝素。

3海洋生物源肝素分析测定方法

3.1肝素效价的测定

肝素效价的测定主要有天青A比色法，生色底物法和生物检定法。天青A为阳离子物质，能与肝素形成肝素-天青A复合物，该复合物在紫外光505nm处有吸收，根据吸光度来判断肝素效价。天青A比色法具有操作简单，耗时短特点。发色底物法操作较为复杂，所用试剂需要现配现用，目前已开发出抗FXα因子试剂盒，抗Ⅱα因子效价试剂盒和抗Xα因子效价试剂盒，使操作简单化和程序化，该方法是目前测定肝素效价最为常用的方法。生物检定法包括羊血浆法和兔全血法，该方法操作简单，但耗时长，且主观误差较大。Andrade等[5]采用发色底物法测得蟹肝素效价为33U/mg，低于普通肝素，并表明其低抗凝活性与其较低硫酸化程度有关。Jeske等[6]采用同样方法测得金枪鱼肝素抗Xa因子最高效价为72U/mg，抗凝血酶最高活性为111U/mg。

3.2肝素结构的分析

肝素的结构与其生物活性密切相关，因此需要对其结构进行分析。肝素结构的测定一般包括分子量的测定、单糖组成分析、红外光谱分析和核磁共振分析等。肝素主要是由两种二糖单位（氨基糖和糖醛酸）重复聚合构成,分离得到的二糖单位重复数不同,所测的分子量会有所差异，常用方法有高效液相色谱法、凝胶排阻色谱法和渗透压法。单糖组成的分析需要将肝素降解为单糖，再通过色谱法和电泳法进行鉴定分析[24]，传统的降解方式是盐酸水解，近年来多用三氟乙酸(TFA)进行水解[25]。基团的连接方式、内部排列顺序和异头碳的结构等都不能依靠一种分析技术分析出来，需要结合多种分析方法才能完成。LI等[26]用热水浸提法从海藻中提取出一种具有抗凝活性的硫酸化多糖，经高效液相凝胶色谱(HPGPC)分析，该糖平均分子质量为513ku，经高效液相色谱（HPLC）分析其单糖组成，结果表明该糖由鼠李糖(84.0%)，木糖(4.8%)，葡萄糖(4.6%)，半乳糖(2.3%)，甘露糖(1.9%)和葡萄糖醛酸(2.4%)组成。Saravanan等[18]对海洋扇贝硫酸乙酰肝素（HS）进行提取，经核磁共振法（HNMR）分析显示，海洋扇贝HS富含葡萄糖醛酸和硫酸化的艾杜糖醛酸残基，且硫酸化程度高，其抗凝血活性与肝素相当。曹九零等[27]建立了一种新型分析方法，多糖经TFA水解和PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化后采用HPLC-MSn（高效液相色谱-多级质谱联用）分析水解产物中的二糖片段，从而鉴定出含糖醛酸的多糖种类，并通过此方法在菲律宾蛤仔、紫石房蛤、文蛤和四角蛤蜊中发现了肝素的存在。Jeske等[6]用凝胶渗透色谱-高效液相色谱联用法（GPC-HPLC）对纯化后的金枪鱼鱼皮肝素进行分析，其平均分子质量为12ku，与临床级的猪肝素分子质量相当。

4海洋生物源肝素的生物活性

肝素具有复杂的结构，同时还具有多样的生物活性。除常见的抗凝血作用之外，还有抗肿瘤、抗平滑肌细胞增殖和抗炎症等作用，肝素的这些生物活性与其特异的结构有关，与抗凝血作用无关[1]。由于海洋环境的独特性，海洋源肝素与陆地生物肝素在组成与结构上存在明显差异，因此具有一些独特的生物活性。近年来，海洋生物源肝素的药用潜力逐渐被发掘出来，比陆地生物源肝素的更多活性功能也逐渐被发现。

4.1抗凝血作用

人体中的血液之所以能维持顺畅的流动，是因为促凝系统和抗凝系统处于一个平衡的状态，前者可形成血块，达到止血的目的，后者阻止血块形成，以保持血管通畅。肝素的主要抗凝机制在于肝素分子链上含有与抗凝血酶（AT）高亲和力的五糖，当肝素与AT接触后，发生构象改变，暴露出反应中心环（RCL），RCL含有重要的蛋白酶底物序列，作用于凝血酶等丝氨酸蛋白酶活性部位，催化其灭活。灭活后若还存在游离AT，肝素可解脱下来催化下一个AT。因此肝素-AT复合物能灭活凝血系统中多数活化的酶，起到抗凝血的作用[1]。肝素的另一个作用机制是激活肝素辅因子Ⅱ而直接灭活凝血因子Ⅱa，该作用是电荷依赖性，不需要依赖五糖结构，但需要较高的肝素浓度，当AT严重缺乏时，该机制可发挥作用[28]。Cesaretti等[22]从一种双壳软体动物Tapesphylippinarum中提取出具有高抗凝血活性的肝素，其APTT值为347±56.6，抗Xa因子活性为317±48.3，高于牛肝素抗凝活性（APPT：145±24.6；抗Xa因子：125±18.7）。Flengsrud等[23]以家兔为实验对象进行了动物实验，发现蛙鱼肝素能够激活抗凝血酶抑制凝血因子IIa和Xa活性的能力。Volpi[29]报道软体动物没有类似哺乳动物的凝血系统，但它们的肝素能够显著促进哺乳动物凝血酶的失活，从而起到抗凝血作用。

4.2抗血栓作用

抗血栓的概念是指机体内预防血栓的形成和溶解已形成的血栓。能抗凝血的药物必定有抗血栓的作用，但有抗血栓作用的物质不一定有或只有微弱的抗凝血活性[1]。血栓形成后，为保持血液顺畅，机体会立即启动纤溶系统以溶解纤维蛋白和血栓。纤溶是由纤溶酶原活化素（PA）激活纤溶酶原引发的。可由组织型PA启动，也可由FⅫa活化激肽释放酶原，激肽释放酶再激活未经活化的尿激酶型PA（u-PA）。肝素可提高血浆PA浓度，抑制PA抑制剂，并增强t-PA和u-PA的作用，而促进血栓溶解。另一方面，血液凝固过程中会产生FⅡa和凝血酶，后者会活化纤溶抑制物（TAFI），导致纤溶酶原活化受阻，纤溶酶不能形成，而不能发挥溶解血块的纤溶作用。FⅡa与内皮细胞表面血栓调节蛋白（TM）结合可使TAFI活化增大1250倍，抗纤溶作用显著提高。研究表明，治疗性浓度的高分子肝素与LMWH均可显著降低FⅡa与TM的亲和力，减少TAFI活化以增强纤溶作用[30]。Dietrich[15]等建立激光诱导大鼠血栓形成模型来测定虾肝素的抗血栓活性，实验结果表明，巴西对虾肝素具有与低分子量肝素相当的抗血栓形成活性。Gomes等[31]从一种软体动物中提取出类肝素化合物，通过体内实验证明，当剂量为1mg/kg时，该化合物能够有效抑制光损伤动脉血栓的形成。

4.3抗炎作用

炎症是由T淋巴细胞,抗体或非免疫组织的损伤引起的免疫识别开始的,免疫识别触发了白细胞的激活、穿透和激素级联放大系统从而引起的一系列反应统称为炎症。在炎症反应过程中，选择素通过与相应的配体结合介导白细胞与血管壁接触，并使其在血管壁上滚动，最终导致白细胞在炎症反应区域聚集，而肝素与相应的葡萄糖胺多糖能与选择素分组结合，干扰自然配体的作用，从而抑制嗜中性粒细胞与活化的内皮细胞结合[32]。Gomes等[33]从一种软体动物Nodipectennodosus中得到了一种肝素类似物，能抑制小鼠脂肪性腹腔炎所致的内皮细胞活化和炎症细胞的聚集。Brito等[34]从凡纳滨对虾虾头中提取出了肝素，在急性炎症模型中，除了能显著减少炎症细胞流入损伤部位外，还能降低炎症动物腹腔灌洗液中基质金属蛋白酶（MMPS）的活性。此外，该化合物具有较低的出血效应，可作为潜在的抗炎药物。

4.4其他活性

肝素的结构是糖胺聚糖中最复杂的，与此相对应的是多样的生物活性。除了上述提到的生物学功能，肝素还具有抗血管生成、抗肿瘤和抗平滑肌增殖等生物活性。Gomes等[33]从软体动物Nodipectennodosus提取的肝素除了具有抗炎活性外，还具有抗肿瘤的作用，该物质通过抑制血管中血小板-肿瘤细胞复合体的形成，显著地抑制肺癌细胞的转移。Arumugam等[7]从青口和长砗磲中分离出具有抗增殖活性的肝素，通过肺动脉平滑肌细胞进行抗增殖试验，结果表明青口肝素比长砗磲肝素的抗增殖活性更好。Dreyfuss[35]等报道从虾头中提取的肝素在激光诱导的CNV及体外模型中的抗血管生成作用，该化合物与生长因子（FGF-2、EGF和VEGF）结合，抑制内皮细胞增殖，可作为治疗老年性黄斑病变的潜在药物。

5展望

肝素具有复杂的结构及多样的生物活性，在临床上发挥了巨大作用，对肝素的研究必将会延续到新世纪。海洋生物源肝素作为传统肝素的替代原料，具有副作用小，与人体细胞兼容性好的特点，但研究上仍有许多问题有待解决，如提取率不如陆地生物源肝素高，无法产业化生产；对其活性机制的研究还不够透彻；未能掌握肝素特异结构与活性间的关系等。所以未来的研究重点应该包括（1）改进海洋生物源肝素的制备和合成，开发出更成熟的提取方法并最终实现产业化生产；（2）开发改进性能的肝素抗凝剂，可研究肝素产生某一副作用的分子量范围，在制备中剔除那一分子量范围的肝素，做到无副作用；（3）开发新的生物活性以及相应的药物或保健品；（4）更新肝素原料库，从更多的海洋生物中提取出肝素。从海洋生物中提取的肝素具有良好的组织结构和抗凝血活性，关于抗血栓、抗炎症、抗血管生成等生物活性已有一些研究，但还有许多活性有待开发，海洋生物源肝素在天然产物药物的开发和用于治疗的新的衍生产品方面具有很大的潜力[36]。随着科技发展，对其结构和活性的研究将会更深入，海洋肝素将有望实现产业化生产，开发出各种海洋保健品和药品等，实现海洋生物资源的深入开发与利用。

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作者：杜振兴1；周斯仪1；钟赛意1,2,3；黄凤娇1；陈观兰1；陈菁1；洪鹏志1,3；章超桦1,3 单位：1.广东海洋大学食品科技学院，2.广东海洋大学深圳研究院，3.广东省水产品加工与安全重点实验室