纳米凝胶的体内外释药规律范文

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《世界中医药杂志》2015年第一期

1材料与方法

1.1实验动物Wistar大鼠，雄性，体重为200～250g。由新华医院实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(沪)2002－0010;使用许可证号:SYXK(沪)2003－0031。适应性饲养7d。

1.2试剂和仪器温敏型辛夷纳米凝胶，自制;洛沙姆407(P407/F127)/泊洛沙姆188(P188):BASF公司;AgilentTechnologies1200系列高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司;InertsilODS-3柱(250mm×4.6mm，5μm):Dikma公司;半透膜(截留分子量7000μ)，上海源聚生物科技有限公司;Franz扩散池，上海黄河仪器仪表厂有限公司。

1.3方法

1.3.1体外释药模式的考察本实验采用Franz扩散池法。在两池间固定半透膜(截留分子量为7000μ)，温敏液约1mL，使其均匀分布在半透膜表面，放入33℃烘箱中5min使其形成凝胶。将扩散池放入33℃水浴中，往接收池中加入己预热至33℃的无水乙醇5mL作为接收液，接收池中置一搅拌子以300r/min的转速转动，分别于5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h分别取样1mL，而后迅速补加等量预热的无水乙醇。样品必要时适当稀释使浓度在标准曲线的范围内，采用HPLC法测定。

1.3.2在体鼻腔吸收规律的考察1)实验动物模型及装置:选择体重在250g左右的健康雄性大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠2.5mL/kg。麻醉后切开颈部，暴露气管和食管，向气管中插入聚乙烯套管，用相同直径的鼻腔套管由食管插向鼻腔后部，将口、鼻腔相连的鼻腭进行封闭，防止药液从口腔流出。用橡胶管与插入大鼠鼻腔后部的套管相连，管子的另一端与清洗液(生理盐水)接触，将盛有生理盐水的容器置于约4℃的冷水浴中。本实验中采用单侧鼻腔给药的方式，另一鼻孔用502胶封闭。给药后，药物在鼻腔中滞留一定时间，用电子蠕动泵使生理盐水从鼻孔中将药液冲出，收集清洗液，用HPLC法测定其中含药量。2)在体鼻腔清洗液用量的考察:为了考察洗净鼻腔内残留药物需用的清洗液量，向一侧鼻孔注入温敏溶液20μL，待形成凝胶后，立刻由鼻腔套管以2mL/min的流速灌注生理盐水。经多次试验表明，至少需要5mL的清洗液，才可达到93%以上的回收率。所以鼻腔内残留药物需用的清洗液量为5mL以上，本实验选择清洗液体积为6mL。3)鼻腔清洗液的收集和测定:单侧鼻腔给予温敏液10μL，待凝胶形成后，用6mL清洗液以2mL/min流速冲洗大鼠鼻腔，取滞留时间为10min、15min、20min、30min、60min、120min的清洗液，补加生理盐水至6mL。采用HPLC法测定，以外标法计算含量，即为温敏凝胶的残余量，吸收药量=给药量－残留药量。

1.3.3高效液相色谱方法的建立1)色谱条件的选择:用气相色谱－质谱法对辛夷挥发油化学成分进行分析，共鉴定出30个成分，占挥发油成分的81%以上，主要包括桉油精、樟脑、α-蒎烯等。本实验选用樟脑作为对照品，建立HPLC法测定药物含量。图1樟脑的紫外图谱2)检测波长的选择:根据《中华人民共和国药典2005年版(二部)》，紫外－可见分光光度法鉴别樟脑，在230～350nm的波长范围内测定吸光度，在289nm有最大吸收。配制浓度为0.904mg/mL的樟脑溶液在200～400nm波长范围内进行紫外扫描。结果见图1。经多次扫描结果表明，樟脑的最大吸收波长为(202±1)nm。虽然202nm为末端吸收，但灵敏度较高，其吸光度约为289nm的8倍左右，所以波长选择203nm。色谱条件如下:色谱柱:InertsilODS-3柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相:乙腈∶水(80∶20)，检测波长:203nm，流速:1.0mL/min，柱温:室温，进样量:5μL。在上述色谱条件下分别测定樟脑、鼻腔分泌物溶液及含有温敏型辛夷纳米凝胶的鼻腔分泌物溶液的色谱图，见图2－图4。图2为樟脑溶液色谱图，图4为含有温敏型辛夷纳米凝胶的鼻腔分泌物溶液的色谱图，由图可见，鼻腔分泌物对温敏型辛夷纳米凝胶的测定没有干扰。3)标准曲线的绘制:精密称取樟脑对照品9.04mg置于10mL量瓶中，加入无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4mL，分别置于2mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀配成不同浓度的溶液。按照HPLC法进行测定，以樟脑峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程y=431.927x－9.99，R2=0.09998。结果表明在浓度0.09～0.63mg/mL范围内，峰面积与浓度具有较好的线性关系，结果见图5。1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，实验数据以(珋x±s)表示，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1温敏型辛夷纳米凝胶的体外释药考察采用Franz扩散池法研究温敏型辛夷纳米凝胶的体外释放情况。计算累积释放量，见表1。由累积释放率对时间作图即可得体外释放曲线，进一步拟合找出释放规律。从试验结果来看，温敏型辛夷纳米凝胶释药模式具有分段性，前30min符合Higuchi方程，以扩散过程为主，可能的原因是这段时间少量游离的辛夷油率先扩散到外面溶液中。30min后呈现零级释药模式，说明此时的凝胶可以连续稳态释药，辛夷油通过凝胶的控释作用释放，成为整个辛夷油释药的限速步骤。温敏型辛夷纳米凝胶12h累积释放率为14%。将温敏型辛夷纳米凝胶在4℃条件下密封储存，平均分成4份，分别在不同时间考察其释药模式，结果发现避光、密封于4度冰箱条件下储存1周、2周、1个月的样品和新制备的样品相比释药模式无明显变化。见表2。

2.2在体鼻腔吸收规律研究采用动力学模型处理，结果表明温敏型辛夷纳米凝胶的吸收符合一级动力学过程，表明其具有缓释效应。

3讨论

变应性鼻炎(AllergicRhinitis，AR)是由免疫球蛋白(IgE)介导通过释放组织胺或其他化学活性物质诱发的鼻黏膜I型变态反应［4］。目前缺少有效的治疗药物，特别是儿童变应性鼻炎患者，西医治疗的一线药物是鼻用糖皮质激素和抗组胺药物，虽然鼻用激素在治疗AR中的疗效确切，但并不能治愈AR，而且停药后有反跳现象，特别是长期让患儿使用其累积的不良反应不可忽视［5］。中医药治疗变应性鼻炎具有疗效显著、不良反应较少的特点。辛夷是治疗变应性鼻炎的常用药物，具有祛风通窍的作用，其有效成分为挥发油，具有广泛的抗过敏药理活性［6］。纳米脂质体是以磷脂为主要材料制成的具有生物膜结构的双分子囊［7］，是一种新型的鼻腔给药载体。前期研究已经成功制备出辛夷挥发油纳米脂质体，既保持了辛夷的药理活性，又具备普通挥发油制剂没有的优势［8］。辛夷纳米脂质体生物相溶性好，脂质双分子层与生物膜有较大的相似性与组织相溶性，易于被组织吸收，可减少对鼻黏膜的毒性和刺激［9］;其次，纳米脂质体保护药物不被鼻腔黏液中的酶降解，并且持续释放包封药物，达到长效缓释的作用［10］。但是液态脂质体的贮存稳定性较差。在贮存过程中极易发生团聚、融合及药物渗漏［11］，且主要膜材磷脂易氧化、水解，难以满足药物制剂稳定性的要求，同时由于温度、光线等影响产生乳析、凝聚、融合、粒径变大等现象，这些变化都对脂质体的应用产生负面的效应，使应用受到了很大限制。为此，必须采用适当的方法来处理液态脂质体来提高其贮存稳定性。低温冷冻干燥技术［12］是提高蛋白、药物等生物活性物质和聚合物药物等体系贮存稳定性的有效手段。

制成的冻干脂质体可显著降低磷脂和药物的水解和氧化速度，同时，冻干保护剂也保持了脂质体膜结构的完整性，克服脂质体聚集、融合及药物渗漏等不稳定因素［13］，显著提高贮存稳定性。目前，该法已成为改善脂质体制剂长期稳定性的方法之一。临床治疗中亦发现，常用的滴鼻液由于鼻纤毛的清除功能，药物在鼻黏膜上停留时间短，仅有15～30min［14］。因此在一定程度上影响了药物的吸收和疗效，且鼻腔容积较小，给药剂量有一定限制［15］。凝胶剂用于鼻腔给药，具有一定的缓释作用，能使药物缓慢持续地被释放，增加了药物与鼻黏膜的接触时间［16］。

但是由于凝胶剂型质地黏稠，不易使凝胶药物进入鼻腔［17］。如能将药物的易于给药性和凝胶剂的缓释性相结合，将会大大提升药物的生物利用度。因此我们创新性地制备温敏型辛夷纳米凝胶，通过温敏凝胶的控缓释系统，进一步提高辛夷挥发油的生物利用度。本实验中通过体外释药实验研究温敏型辛夷纳米凝胶的控缓释性。研究结果显示12h累积释药率为14%，表明该温敏制剂具有明显的控缓释作用。采用大鼠在体鼻腔滞留法考察温敏型辛夷纳米凝胶的鼻腔吸收规律，结果显示符合一级动力学方程，表明该制剂具有缓释效应。挥发油类中药占中药类的35%左右［18］，但因其易挥发、不稳定、刺激性大等缺点限制了临床的应用。我们应用现代纳米技术制备纳米中药，使其便于应用、贮存、运输，并且经过研究证明纳米尺度效应可显著提高药物疗效。但是，纳米技术既是现在临床研究的热点也是难点，我们虽然已经取得了一定的成果，但本课题缺少临床药效学和毒理研究，应在后续研究中进一步展开，以便于应用临床。

作者：张欣吴敏阎秀菊马博单位：上海交通大学医学院附属新华医院中医科