银翘散对流感病毒的保护作用范文

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《世界中西医结合杂志》2015年第五期

1实验方法

1．1银翘散与给药方法煎煮2次，合并滤液，过滤，浓缩至（生药）2g／ml，流感病毒感染小鼠造模后1d开始给药，阳性对照组给药为磷酸奥司他韦溶液（10g／kg）；银翘散组（10g／kg）。小鼠灌胃给药0．1ml／10g，每天同时间点灌胃1次，正常组和模型组每天以等体积的蒸馏水灌胃，连续灌胃给药6d。

1．2分组与造模／实验方法

1．2．1流感病毒半数致死量（LD50）的测定30只BALB／c小鼠，随机分成6组，每组5只，戊巴比妥钠溶液小鼠腹腔注射麻醉，用4℃预冷PBS将增毒后的流感病毒新鲜尿囊液10倍梯度稀释，共设6个浓度，分别为10－1～10－6，将稀释好的6个浓度梯度流感病毒分别以20μl／只滴鼻造模，观察14d，分别观察小鼠发病状态，记录流感病毒各梯度稀释组的死亡数，计算死亡率，按Reed＆Meunch法计算病毒的半数致死量（LD50）［2］。

1．2．2银翘散存活实验分组和流感病毒感染小鼠模型建立40只Balb／c小鼠，随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、阳性对照组、银翘散组，适应性喂养48h。取冻存的流感病毒，冰上解冻，用4℃PBS（pH＝7．4）将其稀释为每20μl含4个LD50的病毒稀释液。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，正常组以20μlPBS滴鼻造模，其余组以20μl病毒稀释液滴鼻造模。

1．2．3银翘散对流感病毒感染小鼠肺指数影响作用160只BALB／c小鼠，随机分为16组，每组10只，分别为正常组1组，模型组5组，阳性对照5组、银翘散5组，适应性喂养48h后进行实验。造模后，分别于第1、3、5、7、9、11、13天每组随机取3只小鼠，禁食不禁水4h，称重，摘眼球方式取血，打开胸腔，无菌条件下取出全肺，生理盐水洗涤2次，滤纸吸干肺组织多余水分，称量肺重，计算肺指数。肺指数＝［肺重（g）／体重（g）］×100。

1．2．4肺总RNA提取和逆转录取50mg肺组织，置于EP管中，向EP管中加入10倍体积TRIzol，加入研磨球，放入研磨仪中60Hz，研磨30s；将匀浆液吸至无RNA酶EP管中，室温静置5min，加入100μl氯仿，上下颠倒震荡15s，4℃，12000g离心10min，吸取上部水相，移至新EP管中，加入300μl异丙醇，混匀，室温静置10min，4℃，12000g离心10min，吸取液相，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀，7500g离心5min，弃上清，室温风干5min，加入无RNA酶水，金属浴55℃溶解10min，检测RNA完整性后，放－70℃保存备用。将模板RNA在冰上解冻，将5×gDNABuffer、FQ－RTPrimerMix、10×FastRTBuffer、RNase－freeddH20室温下解冻，解冻后放冰上。其中去除基因组DNA体系为5×gDNABuffer2μl，模板RNA2μl，RNase－freeddH206μl，混匀，简短离心后置于金属浴42℃孵育3min，置于冰上，然后分别加入10×FastRTBuffer2μl，RT－EnzymeMix1μl，FQ－RTPrimerMix2μl，RNase－freeddH205μl至上步反应体系中，42℃孵育15min，95℃孵育3min后得cDNA，4℃保存。

1．2．5实时荧光定量PCR（RealTime－PCR）检测病毒拷按照SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）荧光定量PCR试剂盒说明书进行实验。根据引物设计原则，设计引物。上游引物为5′GACCAATCCTGTCACCTCTGAC3′；下游引物为5′AGGGCATTNTGGACAAAGCGTCTA3′；为消除不同RNA样本之间的误差，消除RNA使用量不同导致的误差，设管家基因GAPDH作为对照。其中GAPDH的上游引物为5′TGGATTTGGACGCATTGGTC3′；下游引物为5′TTTGCACTGGTACGTGTTGAT3′，引物由军事医学科学院合成。加试剂和模板（只取第3天和第6天模板）加于PCR管中建立反应体系，将PCR管置于PCR仪中进行反应，反应体系为20μl，反应程序条件：50℃25min，92℃3min，92℃15s，55℃20s，68℃20s，37℃30s，共设置40个循环。每个样品重复3次，将得到的Ct（thresholdofcycle）值进行统计学分析［3］，流感病毒拷贝＝2－（样本Ct值－相应GAPDHCt值）。

1．3统计学处理采用SPSS13．0统计学软件进行统计分析，所有实验数据以均值±标准差（x±s）表示。采用SPSS17．0进行统计学分析，多组间差异采用单因素方差分析（one－wayANOVA），以P＜0．05为差异有统计学意义，P＜0．01为差异有极显著性差异。

2结果

2．1小鼠半数致死量（LD50）测定小鼠感染病毒第3天，10－1～10－4稀释病毒感染小鼠均出现体重降低、耸毛、颤抖、喘息、进食减少，聚堆，等症状；第5天开始感染小鼠开始行走摇摆不定，活动减少，除10－6组外，其余各组于第6天开始出现死亡情况。共观察14d，统计各组小鼠死亡数目（见表1），经计算得出流感病毒的LD50为10－4．39。

2．2银翘散对流感病毒感染小鼠的死亡保护作用流感病毒感染正常小鼠后，模型组的动物死亡率为100％，平均存活天数为5．31d，阳性对照组和银翘散组较模型组的死亡率显著降低，平均存活天数显著增加（P＜0．01），可见阳性对照组和银翘散组可有效保护流感病毒感染小鼠，提高生存率。结果见表2。

2．3银翘散对流感病毒感染小鼠模型肺脏病毒滴度的影响实验分别取小鼠感染第3天和第5天的逆转录的cDNA进行realtime－PCR实验，结果显示：正常组小鼠肺组织内无病毒载量表达；采用甲型流感病毒感染正常小鼠后，模型组各点小鼠肺组织病毒载量均显著表达（P＜0．05），感染后给予用药的阳性对照组及银翘散组中，银翘散组在感染后第3天和第5天病毒载量均显著低于同时间点模型组（P＜0．05）。这表明银翘散具有较好的抑制流感病毒作用。结果见表3。表3银翘散对流感毒感染小鼠肺脏病毒载量的影响（x±s）组别剂量（g•kg－1）病毒拷贝（copies）3d5d正常组－00模型组－5．75×106±2．14×105a7．35×106±3．17×105a阳性对照组102．29×106±1．79×105ab3．51×105±1．29×104ab银翘散组54．65×106±1．53×105b5．79×106±1．25×105b注：与正常组比较，aP＜0．05；与模型组比较，bP＜0．05

2．4银翘散对流感病毒感染小鼠肺指数的影响结果显示，流感病毒感染正常小鼠后，模型组小鼠的肺指数持续增加，在第7天达到最高值，在第9天时全部死亡，说明成功建立流感病毒小鼠模型。银翘散组除第9天时肺指数略高于模型组外，其余各个时间点均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0．01）。阳性对照组各个时间点的肺指数均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0．01）。银翘散组的肺指数要高于阳性对照组，提示阳性对照组对小鼠感染流感模型的保护作用要优于银翘散组。总体上，银翘散组在肺指数指标上对流感感染小鼠具有保护作用。结果见表4。

3讨论

目前，流感仍是严重威胁人类健康的流行性疾病。中医学认为流感属“瘟病”范畴，由人体感受风邪病原侵袭，机体免疫力低下，不足以抗邪而得病，具有极强的传染性，是能够引起大范围流行的外感热病［4］。中药治疗疾病的基本原则为扶正祛邪，中药抗流感的作用机制可能是通过阻断流感病毒侵入宿主过程中的吸附、穿入、复制、成熟中的某一环节而直接抑制病毒，并通过提高机体的免疫功能，促进机体的特异性和非特异性免疫功能而间接抑制病毒［5］；中药抗流感同时重视病毒—机体—药物三者之间的辨证施治关系，不仅可以清除体内流感病毒，同时还能改善机体状态，通过调动机体免疫功能来增强抗病毒感染的能力，相比于化学药物，具有优越性。中药在抗流感病毒方面通过抑制病毒复制、调节免疫功能、改善血液循环、解热镇痛、抗菌消炎等多途径发挥作用，相关药理研究［6］也发现银翘散具有抗金黄色葡萄球菌等作用。通过动物实验探讨中药抗流感病毒的效果，是从整体水平反映机体内抗病毒作用的有效途径。中药方剂的药效作用是通过机体的整体作用来体现，因此动物实验在抗流感病毒研究中具有十分重要的意义。本实验按郭元吉［7］的小鼠感染流感病毒模型的方法，用甲型流感病毒FM1毒株滴鼻感染正常Balb／c小鼠，造成流感病毒性肺炎小鼠模型，以死亡率、肺指数和肺脏病毒拷贝为评价指标，评价银翘散的抗流感病毒FM1株作用。本实验结果表明，银翘散可以提高感染小鼠的存活率，延长银翘散用药组存活时间和降低肺脏病毒载量，说明银翘散在体内防治流感方面具有较好疗效，能够改善病毒感染所致机体的病变。充分体现了中医治疗的整体观，也一定程度上揭示了中药抗流感病毒在扶正与祛邪方面的科学性。

作者：张照研 张会敏 周喆 王升启 单位：．河南中医学院 山东省中医药研究院 军事医学科学院