免疫性疾病患者筛查结果范文

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《山东大学学报》2016年第一期

摘要：

目的探讨风湿免疫性疾病患者潜伏结核感染（LTBI）状况及影响结核感染T细胞斑点试验（TS0POT．TB）结果的相关因素。方法选取2013年6月至2014年6月风湿免疫性疾病患者223例（病例组）和健康人群53例（健康对照组），抽取外周血，应用结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6和CFP10刺激，对致敏T细胞应答反应进行检测，并记录糖皮质激素和改善病情的抗风湿药物（DMARDs）应用情况及LTBI高危因素。结果病例组TSPOT．TB阳性检出率为20．18％，显著高于健康对照组5．66％；病例组发生结核菌感染的相对风险（OR）是健康对照组的4．21倍（95％CI：1．21～14．70，P＜0．05）。病例组TSPOT．TB阳性检出率和发生LTBI的风险存在明显差异（P＜0．01），结节性红斑患者组TSTPOT．TB阳性检出率最高达44．0％，发生结核菌感染的风险是健康对照组的13．11倍（95％CI：3．44～49．98，P＜0．01）；类风湿关节炎患者阳性率为21．16％（OR值4．47，95％CI：1．06～18．82，P＜0．05）；其他风湿免疫性疾病TSTPOT．TB阳性检出率10．0％～33．34％（OR值1．85～8．33，P＞0．05）。TSPOT．TB阳性和阴性应用糖皮质激素和DMARDs治疗患者所占比例差异均无统计学意义（P＞0．05）；既往TB感染史和CT检查结果异常与TSPOT．TB阳性结果显著相关（P＜0．01）。结论风湿免疫性疾病患者发生LTBI风险是健康对照组的4．21倍，TSPOT．TB试验受激素及DMARDs药物影响较小，是LTBI筛查的有效方法。

关键词：

风湿免疫性疾病；潜伏结核感染；筛查；结核感染相对风险度；影响因素

风湿免疫性疾病是以皮肤、关节、血管及多系统损害为主或伴免疫功能异常的一类疾病。该病由于使用激素、免疫抑制剂，尤其是生物制剂治疗等原因，成为结核菌感染的易感人群［16］，在接受肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）拮抗剂治疗期间，风湿免疫性疾病发生结核感染的风险是不用TNF拮抗剂治疗患者的4倍，最高可达25倍，除活动性肺结核外，很多患者表现为痰菌阴性、无症状的潜伏结核感染（latenttuberculosisinfection，LTBI）［24］。因此，在接受生物制剂治疗前对风湿免疫性疾病患者进行有效的LTBI筛查，并进行预防性抗结核治疗尤为重要。传统的结核感染筛查方法是结核菌素皮肤试验（tuberculinskintest，TST），该方法因卡介苗（bacilluscalmetteguerin，BCG）接种和免疫抑制剂应用等因素的影响，易出现假阳性和假阴性，造成临床对结核病的漏诊和误诊［26］。结核感染T细胞酶联免疫斑点试验（Tcellbasedenzymelinkedimmunospotassay，TSPOT．TB）主要是用结核分枝杆菌两个特异性抗原ESAT6和CFP10刺激外周血T淋巴细胞，通过检测致敏淋巴细胞数量来诊断结核菌感染的技术，为LTBI的早期发现提供了新的诊断方法，其灵敏度和特异性均高于TST法［68］，国外有研究应用TSPOT．TB检测替代TST试验用于风湿病患者LTBI的筛查［4］，而国内有关研究较少。本研究通过探讨风湿免疫性疾病患者LIBI发生率和发生结核感染的相对风险度（oddsratio，OR），为结核病的早期预防和治疗提供依据，以降低结核病的发生和传播。

1资料与方法

1．1临床资料

1．1．1研究对象选取2013年6月至2014年6月在潍坊市人民医院风湿免疫科门诊和住院的风湿免疫性疾病患者223例（病例组），其中男85例，女138例，11～83岁，平均（44．0±7．8）岁；同时选取我院查体中心健康人群53例（健康对照组），其中男20例，女33例，9～59岁，平均（39．0±5．4）岁。病例组符合相应的风湿免疫性疾病诊断标准，均未发现活动性结核，部分患者拟接受生物制剂治疗；病例组登记卡介苗（BCG）接种史、发病史、治疗药物、LTBI高危因素（包括结核病史及家族史、近期结核病接触史、胸部CT检查结果为结节、片状阴影、钙化灶、肺炎、积液、脊柱或骶髂CT检查为关节炎性改变）等相关信息。健康对照组均经胸部X线、生化及免疫学等检查结果证实无异常，无结核（tuberculosis，TB）病史、家族TB感染史、近期结核患者密切接触史等。两组均无人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染和严重的肝肾功能损伤。

1．1．2主要试剂与仪器X15R台式离心机（美国，贝克曼公司），HF90CO2培养箱（上海力康医疗设备有限公司），BX2显微镜（日本，Olympus）；TSPOT．TB试剂盒（英国OxfordImmunotec生产，上海复星长征医学科学有限公司提供）：

1．2方法

1．2．1标本采集采集静脉血5mL于肝素抗凝的真空管内，充分混匀，4h内送检。血常规白细胞＜3．0×109／L和／或淋巴细胞绝对值＜0．85×109／L抽取10mL肝素抗凝血送检。

1．2．2外周血单个核细胞分离5mL肝素放凝血加等量RPMI1640培养基混匀后，叠加于盛有4mL淋巴细胞分离液的无菌离心管中，2000r／min离心20min，吸取PBMCs细胞层，RPMI1640培养基洗涤2次，加0．5mLAMIV培养基悬浮细胞并计数，根据计数细胞数量，用AMIV培养基配制2．5×105／mLPBMCs的细胞悬液。

1．2．3采用酶联免疫斑点法检测致敏淋巴细胞数量按说明书操作，每份标本设阴性对照孔，A、B检测孔和阳性对照孔，分别加入AMIV培养基、A抗原（ESAT6）、B抗原（CFP10）和PHA各50μL，每孔加稀释好的PBMCs细胞悬液各100μL，置37℃、5％CO2培养箱培养16～20h，PBS冲洗4次；每孔加稀释好的酶标记抗体50μL，2℃～8℃孵育1h；PBS冲洗4次，加入底物，暗处显色7min，蒸馏水终止反应；37℃干燥15～20min，显微镜下计数斑点数。阳性判断标准：①阴性对照孔斑点数为0～5个：A或B检测孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6个为阳性；②阴性对照孔斑点数为6～10个：A或B检测孔斑点数≥2倍阴性对照孔斑点数为阳性；同时阳性对照孔斑点数必须≥20个。

1．3统计学处理采用SPSS13．0统计学软件，率的比较采用χ2检验，计量资料以x珋±s表示，两者间计量资料采用t检验，相对风险度以比数比（Oddsratio，OR）表示，OR值95％可信区间（Confidenceinterval，CI）采用Miettinen法计算。P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1两组临床资料比较病例组类风湿关节炎52例（23．32％）、强直性脊柱炎32例（14．35％）、系统性红斑狼疮29例（13．01％）、结节性红斑25例（12．21％）、系统性血管炎24例（10．77％）、结缔组织病16例（7．18％）、白塞氏综合症10例（4．49％）、成人斯蒂尔病8例（3．59％）、干燥综合征7例（3．14％）、未分化脊柱关节炎7例（3．14％）、银屑病关节炎7例（3．14％）、风湿性多肌痛6例（2．69）。84例（37．67％）患者服用小剂量类固醇激素治疗，99例（44．40％）患者接受DMARDs药物治疗。121例（54．26％）患者存在LTBI高危因素，其中有TB感染史14例（6．28％）、胸部或脊柱及骶髂等部位CT检查结果异常（主要为肺部结节、片状阴影、钙化灶、肺炎、积液、脊柱或骶髂关节炎性改变等）99例（44．40％）、近期TB患者接触史2例（0．90％）、家族TB感染史6例（2．69％）。218例（97．76％）患者接种BCG，健康对照组均接种过BCG。

2．2两组TSPOT．TB检测结果病例组TSPOT．TB阳性检出率（20．18％）显著高于健康对照组（5．66％），病例组发生结核菌感染的风险是健康对照组的4．21倍（95％CI：1．21～14．70，P＜0．05）。病例组结节性红斑患者TSPOT．TB阳性检出率达44．0％，发生结核菌感染的风险是健康对照组的13．11倍（95％CI：3．44～49．98，P＜0．01）；25例结节性红斑患者均为继发性，其中11例TSPOT．TB阳性结节性红斑患者进行了皮下结节活检，8例炎细胞浸润，干酪样坏死以及上皮样细胞和单核细胞组成的结核样浸润，诊断为结核性结节性红斑；3例皮下组织间隔性脂膜炎，淋巴细胞和巨噬细胞浸润，未见干酪样坏死和肉芽肿病变。14例TSPOT．TB阴性结节性红斑患者拒绝活检。类风湿关节炎阳性检出率21．16％（OR＝4．47，95％CI：1．06～18．82，P＜0．05）；风湿性多肌痛和强直性脊柱炎等其他风湿免疫性疾病患者，虽然TSPOT．TB阳性检出率均高于对照组，但差异均无统计学意义（P＞0．05）。见表1。

2．3病例组TSPOT．TB检测结果与相关因素分析TSPOT．TB阳性和阴性患者，应用糖皮质激素和DMARDs治疗及LTBI高危因素所占比例比较差异无统计学意义（P＞0．05），见表2。LTBI高危因素分析显示，9例TSPOT．TB阳性患者（20．0％）具有TB感染史，显著高于阴性患者5例（2．81％）（χ2＝18．04，P＜0．01）；45例TSPOT．TB阳性患者中28例（62．22％）胸部、脊柱及骶髂CT检查结果疑似结核，而178例TSPOT．TB阴性患者中71例（39．89％）CT检查结果疑似结核，两者比较差异有统计学意义（χ2＝7．26，P＜0．01）；具有TB家族史患者TSPOT．TB阳性和阴性分别为1例（2．22％）和5例（2．81％），差异无统计学意义（P＞0．05）。14例TB感染史患者肺部CI结果提示：肺部结节或陈旧性结核病灶8例，病史均在6年以上。99例应用DMARDs治疗的患者，其中17例应用甲氨蝶呤（MTX），74例应用羟氯喹，8例MTX和羟氯喹联合应用，TSPOT．TB阳性检出率分别为29．42％、25．43％和14．29％，差异无统计学意义（χ2＝1．089，P＞0．05）。

3讨论

结核病是一个全球性的公共健康问题，也是我国重点控制的疾病之一。较多研究重点放在活动性结核的治疗上，缺乏对LTBI的诊断和预防性措施的深入研究。除活动性结核外，众多患者表现为痰菌阴性的LTBI，极易被漏诊、误诊，进而发展成为活动性结核导致结核病的传播和蔓延，到目前为止尚缺乏有效的LTBI诊断方法。传统筛查结核感染的TST试验，其结果受多种因素影响，接种BCG、环境中的非结核分枝杆菌感染、重复试验的加强反应等均可导致假阳性结果，使用免疫抑制剂治疗的风湿免疫病、营养不良、体质较弱、感染结核14d内的患者，TST试验均可出现假阴性［36］。近年IGRAs作为结核感染诊断方法，已逐步被临床接受。TSPOT．TB试验通过测定分泌IFNγ的T细胞数量来诊断结核感染，所用的刺激抗原为ESAT6和CFP10，不受BCG接种和大多数NTM影响，因而其灵敏度和特异性较高。2013年美国CDC推荐IGRAs替代TST作为LTBI的筛查方法［7］，2006年瑞士在制定的“抗TNFα治疗前结核感染筛查指南”中肯定了IGRAs试验的作用，一致认为如IGRAs结果为阳性，患者有可能为LTBI，建议进行预防性治疗（异烟肼或者利福平）［4］。

结核分支杆菌感染是抗TNF治疗的一种严重并发症，加强高危人群的筛查和预防性抗痨治疗，可有效减少抗TNF制剂导致的结核感染风险。TSPOT．TB试验检测结果不受强的松龙（prednisolone，PSL）的影响，特异性显著高于TST方法，TSPOT（）／PPD（＋＋）的RA患者在未接受预防抗涝治疗下按计划接受生物制剂治疗，随访过程中未发生活动性结核，认为该试验是风湿病患者LTBI筛查的有效方法［910］。Xie等［11］研究认为，在结核发病率和BCG接种率较高的中国，TSPOT．TB试验在诊断风湿病患者LTBI中比TST具有更高的特异性。目前多数研究针对TST与TSPOT．TB检测结果进行比较，尚缺乏对风湿免疫性疾病不同病种患者结核感染易感性的研究报道。本研究结果表明，风湿免疫性疾病患者发生结核菌感染的风险是健康对照组的4．21倍，不同风湿免疫性疾病患者发生结核感染的风险存在明显差异，TSTPOT．TB阳性检出率和OR值由高到低分别为：结节性红斑、风湿性多肌痛、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性血管炎、干燥综合征、未分化脊柱关节炎、系统性红斑狼疮、结缔组织病、成人斯蒂尔病、白塞氏综合征，继发性结节性红斑与结核杆菌感染密切相关，既往TB感染史和胸部、脊柱及骶髂CT检查结果异常与TSPOT．TB检测结果显著相关；糖皮质激素和DMARDs治疗对TSPOT．TB试验结果影响较小，故TSPOT．TB试验更适合免疫低下、接受免疫抑制剂治疗患者LTBI的检测。

综上所述，TSPOT．TB试验具有较高的敏感性和特异性，虽然假阴性、不确定影响因素（如Treg）和不确定结果也存在，但是其发生率远低于TST试验。我国是BCG接种率较高的国家，风湿病人群中TST阳性／TSPOT．TB阴性的比例高达26％，应用TSPOT．TB检测可减少不必要的预防用药给患者带来的伤害。本研究报道了不同风湿免疫性疾病患者TSPOT．TB阳性检出率，以及相对健康对照组可能发生LTBI的OR值，对指导临床早期预防和治疗LTBI患者，避免结核病的传播具有重要意义。

作者：盖林林 管立学 李海波 褚锦锦 朱芸 李明 单位：潍坊医学院临床检验诊断学教研室 潍坊市人民医院中心实验室 潍坊市人民医院风湿免疫科