小脑早期发育思考范文

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《南京医科大学学报》2015年第七期

1材料和方法

1．1材料B6小鼠（南京大学动物模式所），129-Ptch1tm1Mps／J（简称Ptch1＋／-，美国JacksonLab引进），多聚甲醛粉末（P6148，Sigma公司，美国），石蜡（A6330，Sigma公司，美国），柠檬酸盐抗原修复液（福州迈新公司）、封闭用正常山羊血清（北京中杉金桥公司），抗体稀释液（CellSignalingTechnology公司，美国），浓缩型DAB试剂盒、兔超敏两步法免疫组化检测试剂盒、小鼠超敏两步法免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥公司），Fluoromount抗淬灭剂、封片剂（Sigma公司，美国），一抗：兔抗Pax6（Co-vance公司，美国），小鼠抗NeuN（Millipore公司，美国）。二抗：驴抗小鼠AlexaFluor594、驴抗兔Alex-aFluor488（Invitrogen公司，美国）。45％左右旋葡萄糖溶液、SPITE、OleicAcidAlbumin／LinoleicAcid和N-AcetylCysteine粉末（Sigma公司，美国），Neuralbasalmedium、Pen／Strep、Glutamine、B27（Gibco，Invitrogen公司，美国），Percollstocksolution（GEhealth-care公司，美国）。DNase、Trypsin粉末（Amresco公司，美国）。实验室自制含Shh配基的条件培养基（ShhN-CM）、对照培养基（293T-CM）。Click-iT禄REdUAlexaFluor禄R555ImagingKit（LifeTechnologies公司，美国）、MEM、Eagle培养基、马血清、glutamaxⅠ、10％葡萄糖（Gibco，Invitrogen公司，美国），器官培养微孔滤膜（Millipore公司，美国）。

1．2方法

1．2．1小鼠脑组织免疫荧光检测将实验所需的出生2、7、14d（P2、P7、P14）的B6小鼠用75％的酒精喷湿消毒，用剪刀将小鼠断头后剪开小鼠头部皮肤，沿矢状缝剪开颅骨，剥离脑组织，放入50mL4％多聚甲醛4℃过夜，第2天分离小脑，沿矢状缝将小脑分成2部分，固定12h。将固定后的脑组织取出，脱水，透蜡，包埋，切片。将切好的小鼠石蜡切片放入二甲苯中脱蜡3次，100％～50％酒精梯度脱水、柠檬酸盐高温抗原修复、5％正常山羊血清（TBS稀释）封闭1h，分别滴加一抗Pax6和NeuN4℃孵育过夜、TBS洗3次，每次2min，PBS按1∶200的比例稀释相对应的荧光二抗，室温避光孵育1～2h，TBS洗3次，每次2min，用含DAPI的防荧光淬灭的封片剂封片，倒置荧光显微镜拍照。

1．2．2P7小鼠小脑GCP细胞的分离、纯化、培养及EdU检测取出生后7d的小鼠小脑GCP细胞分离、纯化、种板培养24h后，向细胞培养液中分别加入ShhN-CM和293T-CM，刺激细胞，每2d换1次液，之后做EdU检测（检测步骤同下文所述），倒置荧光显微镜观察拍照。

1．2．3小鼠脑片体外培养系统的建立及应用取出生7d的小鼠脑组织，在体式镜下将小脑分离至含有1×glutamax的冰MEM中；用组织切片机将小脑沿矢状面切成厚度为350μm的脑片；将脑片分成单个，转移到放置在含有1mL培养基的6孔板微孔滤膜上，5％CO237℃培养箱中培养。成功建立脑片体外培养系统后，我们分别对体外培养的脑片做相应处理后做EdU检测：配置2×EdU工作液，加入培养皿，使其终浓度变成1×，37℃孵育30min，4％多聚甲醛4℃固定过夜，3％BSA／PBS洗2次，1mL0．5％TritonX-100／PBS透化，室温孵化40min，3％BSA／PBS洗2次，每孔加入250μL的1×Click-iT反应液，室温避光孵育30min，700μL3％BSA／PBS洗2次，去离子水洗脑片1次。将脑片平放至载玻片上，含有DAPI的封片剂封片，4℃避光保存，倒置荧光显微镜观察。

1．2．4小鼠脑组织HE染色将脑组织石蜡切片依次放入：二甲苯中3次，每次10min；二甲苯∶无水乙醇（1∶1）1min，100％、95％、85％、75％和50％乙醇各1min，ddH2O中1min，苏木素染液1～2min；自来水洗2次，每次各1min；ddH2O中1min，伊红染液1～2min，95％乙醇1min，100％乙醇1min；二甲苯2次，每次1min，中性树脂封片，通风后倒置荧光显微镜观察。

1．3统计学方法实验数据采用SPSS18．0进行分析。数据用均数±标准差（x±s）表示。采用重复资料测定方差分析和t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1小鼠出生后7d是小脑外颗粒层GCP细胞增殖的高峰取P2、P7、P14小鼠小脑，免疫荧光检测颗粒细胞及GCP细胞的蛋白标记物Pax6和分化成熟的颗粒神经元蛋白标记物NeuN的表达情况。我们观察到，P2小鼠小脑Pax6表达阳性的外颗粒层只有薄薄的一层，整个小脑几乎没有NeuN的表达；P7小鼠小脑中Pax6在EGL的表达变成厚厚的一层，并且出现了NeuN阳性的内颗粒层，P14小鼠小脑外颗粒层的GCP细胞大部分都停止增殖，向内迁移停留在内颗粒层，而外颗粒层则变得越来越薄，内颗粒层越来越厚（图1）。上述结果与其他文献报道一致，即小鼠在出生后小脑外颗粒层的GCP细胞会不断增殖，在出生后7d达到增殖高峰；随着小脑的不断发育，一些GCP细胞退出细胞周期，向小脑的内部迁移，慢慢成为分化成熟的颗粒神经元细胞，形成内颗粒层。

2．2Shh信号是促进小脑外颗粒层细胞增殖的重要信号为了探究Shh信号通路在小脑外颗粒层细胞增殖中所起的作用，我们取P7小鼠小脑的颗粒前体细胞的原代细胞，并且分别用含有Shh配基的条件性培养液和对照培养液培养细胞120h，EdU染色观察细胞的增殖变化。结果发现，不加Shh配基培养的细胞EdU阳性细胞数极少，而加了Shh配基培养的细胞EdU阳性细胞数明显增加（图2），结果表明Shh信号在刺激小脑外颗粒层细胞的增殖中起了至关重要的作用。

2．3小鼠小脑脑片体外培养系统的建立及应用为了更直观地观察小脑的动态发育过程，我们分离P7小鼠小脑进行体外培养。EdU染色结果显示，体外培养48h，增殖的细胞开始出现在外颗粒层和分子层，继续培养48h，EdU阳性细胞在小脑整个外颗粒层、分子层和内颗粒层都有分布（图3A）。统计48、96h的EdU阳性细胞数在外颗粒层－分子层（EGL＋ML）和内颗粒层（IGL）所占的百分比发现：体外培养48h，EdU阳性细胞有70．64％分布在外颗粒层和分子层，仅29．46％分布在内颗粒层；而在体外继续体外培养48h后，外颗粒层和分子层EdU阳性细胞降到42．65％，内颗粒层EdU阳性细胞增加到57．34％（图3B）。说明内颗粒层的细胞是由外颗粒层或分子层迁移而来。因此，通过体外培养小脑脑片，我们可以清楚地看到颗粒细胞由外颗粒层向内颗粒层迁移的轨迹。为了进一步了解Shh信号在小脑外颗粒层细胞的增殖及迁移中所起的作用，在体外培养的小脑脑片中，利用CPA———Shh信号通路的小分子抑制剂处理脑组织切片24h后，发现处理组脑片中EdU阳性细胞明显低于对照组（DMSO处理），且与对照组相比发现外颗粒层和分子层E-dU阳性细胞数虽然减少，但是在不同条件下内颗粒层的EdU阳性细胞数相对减少并不明显（图3A）；统计分析小脑各层的EdU阳性细胞数发现，虽然CPA明显降低EGL的EdU阳性细胞，但是对IGL层几乎没有影响（图3B、C）。这一结果表明，在小脑发育进程，Shh信号的主要作用是促进小脑外颗粒层GCP细胞增殖，但不影响其迁移。

2．4Shh信号通路异常激活后小鼠小脑外颗粒层出现异常增殖的细胞。为了探究Shh信号异常激活对小鼠小脑外颗粒层细胞增殖的影响，我们分别取出生后17d的野生型（WT）和Ptch基因敲除（Ptch＋／-）的基因型小鼠的小脑，做了HE染色和免疫荧光检测GCP细胞增殖的蛋白标记物Ki67及成熟分化的颗粒神经元的蛋白标记物NeuN的表达情况。HE染色结果观察到，与野生型的小鼠小脑（图4A、B）相比，Ptch＋／-基因型小鼠的小脑外颗粒层出现了一层异常的细胞（图4E、F）。免疫荧光检测Ki67和NeuN观察到，野生型小鼠小脑的外颗粒层几乎没有Ki67的表达，内颗粒层NeuN大量表达（图4C、D），Ptch＋／-基因型小鼠小脑外颗粒层Ki67出现阳性表达，内颗粒层Ne-uN大量表达（图4G、H）。结果表明SHH信号通路异常激活后，小鼠小脑外颗粒层的细胞会出现异常增殖，并且这些异常增殖的细胞不能够顺利向内颗粒层迁移。

3讨论

本文研究了Shh信号通路在小脑发育早期通过影响小脑EGL层的GCP细胞的增殖及迁移而影响小脑的发育。大量研究表明在小脑发育过程中，若Shh信号通路中的Ptch基因发生突变，导致信号通路过度激活，会引起EGL层过度扩增，这可能与MB的发生密切相关。但这一过程发生的分子机制尚不清楚。我们通过建立一个新的模拟体内实验的系统，更加直观清楚地观察小脑发育早期EGL层GCP细胞的增殖、迁移及Shh信号通路在小脑外颗粒层GCP细胞的增殖及迁移过程中所起的作用。并利用实验室引进Ptch＋／－小鼠这一实验动物模型观察在小脑发育早期Shh信号通路异常激活对小脑EGL层GCP细胞增殖的影响，希望能够找出MB可能发生的分子机制。首先，我们通过石蜡切片免疫荧光实验检测了P2、P7和P14小鼠小脑中颗粒细胞、GCP细胞和成熟分化了的颗粒神经元的表达情况，发现在出生后7d的小鼠小脑中GCP细胞的增殖最为明显，随着时间的推移，到14d时GCP细胞大部分都停止增殖，并向内迁移停留在内颗粒层。随后，我们取P7小鼠小脑的GCP细胞的原代细胞进行体外培养，并分别用加入Shh配基和不加配基刺激细胞，结果发现加入Shh配基的细胞不断增殖，不加Shh配基的细胞几乎没有增殖信号，这表明Shh信号通路是促进小脑外颗粒层细胞增殖必不可缺的一部分。为了更加接近体内及更加直观真实地观察小脑的动态发育过程，我们成功建立了体外培养小脑脑片系统，通过这一系统的建立我们清楚地观察到颗粒细胞由外颗粒层向内颗粒层迁移的轨迹，并与前期石蜡切片免疫荧光实验完全符合。同时，在这一系统成功建立的基础上利用CPA这一Shh信号通路的小分子抑制剂处理脑组织切片24h后，发现处理组脑片中EdU阳性细胞明显低于对照组（DMSO处理），说明CPA明显抑制了颗粒细胞前体的增殖。再统计分析小脑各层的EdU阳性细胞数发现，虽然CPA明显降低了EGL的EdU阳性细胞，但是对IGL层没有影响。这一结果表明，在小脑发育过程中，Shh信号的主要作用只是促进小脑外颗粒层GCP细胞的增殖，不影响其迁移。最后利用实验室引进Ptch＋／－小鼠模型，通过对出生后17dWT和Ptch＋／－小鼠小脑石蜡切片HE染色和免疫荧光检测发现，Shh信号通路过度激活会引起小脑外颗粒层细胞异常增殖，并且这些异常增殖的细胞不能够顺利向内颗粒层迁移。Shh信号通路对小脑早期发育的调控是极其复杂的，它的异常激活与MB的发生也密切相关［18］，但Shh信号通路是通过怎样的途径调节小脑的发育，MB发生的确切分子机制怎样尚不清楚。本研究从细胞分子水平上重现了小脑发育早期相关细胞的增殖、迁移情况，为MB发生的可能分子机制提供了新的理论依据，同时，成功建立体外小脑脑片培养系统，也为我们后期观察其他信号通路对小脑发育的调控提供了非常有利的实验工具。

作者：刘晓同 李三恩 乐糰 程雁 单位：南京医科大学发育遗传学系