自身免疫性肝病的抗体检测范文

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《临床检验杂志》2014年第六期

1自身免疫性肝病的抗体诊断指标

1．1PBC2009年AASLD与2010年欧洲肝病研究学会(EuropeanAssociationFortheStudyoftheLiver，EASL)推荐的PBC诊断标准［6-7］:(1)存在胆汁淤积的生化学证据，主要是碱性磷酸酶(ALP)升高;(2)抗线粒体抗体(AMA)阳性;(3)组织学上存在非化脓性破坏性胆管炎以及小叶间胆管破坏的表现。满足以上3条标准中的两条即可诊断PBC。1965年Walker等用IIF技术发现PBC患者血清中存在AMA，是PBC的标志性自身抗体，特别是AMA-M2亚型阳性对PBC的诊断具有高度敏感性和特异性，其阳性率达90%～95%。AMA-M2亚型的靶抗原为线粒体上2-氧酸脱氢酶复合体(2-OADC)的一些成分。2-OADC包括丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)、支链二酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(BCOADC-E2)、2-酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚单位(OGDC-E2)以及二氢硫辛酰胺脱氢酶结合蛋白(E3BP)，最常见的反应是针对PDC-E2。AMA阴性也不能完全排除PBC的患病可能，约5%～10%的患者中AMA阴性，但其临床表现与AMA阳性患者相同。此外，研究表明AMA与疾病的进展不相关［8］。除了AMA，50%左右的PBC患者也能检测到ANA阳性，其常见荧光模式包括斑点型、多核点型、核周型和抗着丝粒型。一般认为，多核点型ANA和核周型ANA具有PBC疾病相关性。多核点型ANA的靶抗原是核体复合物，主要包括Sp100、早幼粒细胞性白血病(PML)抗原、微小泛素相关修饰因子(SUMO)以及新近确定的Sp140。核周型ANA的靶抗原是核孔复合物和核膜，其中，核孔复合物主要包括gp210和p62，核膜蛋白是核纤层蛋白B受体(LBR)。抗gp210、抗Sp100抗体可以作为判断预后好坏的一种特异性标志物［9］。

1．2PSCAASLD于2010年的《PSC诊疗指南》［10］中建议:出现ALP和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)升高等胆汁淤积生化特征，胆管造影检查包括磁共振胆管造影(MRC)、内镜逆行胆管造影(ERC)、经皮肝穿刺胆管造影(PTC)等显示具有典型的多灶性胆管狭窄和节段性扩张的胆管改变，并除外继发性硬化性胆管炎，则可以诊断为PSC。PSC组织学改变为大、中型胆管弥漫性炎症和胆管周围“洋葱波”样纤维化，胆管闭塞、胆汁淤积、胆管减少。PSC患者会出现高球蛋白(IgG、IgM)血症，血清中ALT、AST、胆红素上升。大部分PSC患者非典型pANCA阳性。但PBC和AIH患者中也有非典型pANCA的出现，因此pANCA阳性不能作为PSC的特异性确诊指标［11］。

2自身免疫性肝病的抗体检测技术

2．1IIF法IIF使用具有较大核仁细胞的组织或者HEp-2细胞作为抗原来源，用于细胞内抗原定位或相应抗体(如ANA、AMA、ASMA、抗LKM-1等)检测，是研究自身免疫性肝病使用最为广泛的方法。该方法能够区别不同荧光类型，特异性较高。但手工操作及人工判读结果均存在主观误差。虽然某些IIF自动稀释系统和判读系统已经上市，但其标准化和自动化进程仍然落后于其他实验室技术。一些研究者认为免疫荧光技术已经过时，可以用酶免疫分析或其他试验技术来取代［12］。但是，因为其抗体谱全面和能够发现未知抗体，IIF仍然是扫描自身免疫疾病抗体ANA的推荐方法。ANA由于包括了多种针对不同抗原的抗体，底物特异性相对较差。IIF实验主要基于手工操作，结果判断人为因素较大，容易造成结果判断的个人差异和室间差异。由于ANA缺少疾病特异性，将来会更多地应用于常规普查。对于特异疾病的诊断，ANA的检测会逐步被针对特异抗核蛋白或DNA的抗体检测所替代。

2．2ELISA20世纪90年代后期，开发了商业ANA酶免疫分析(EIA)法检测试剂盒，但因未获得与IIF相同的检测结果而未被广泛使用。近年新型商品ANA-EIA试剂盒通过使用含有纯化或重组抗原的HEp-2细胞核提取物作为底物，达到了很高的敏感性和较高阴性预测值。针对AMA检测的ELISA方法，早期以PDC-E2为底物。为提高AMA-M2检测的敏感性，一些AMA检测方法加入以丙酮酸脱氧化氢酶复合物中3个脱氢酶的C端连接组成的重组蛋白质作为底物。ELISA法与IIF相比，以吸光度(A)值代替滴度，以特异性抗体取代荧光模式，酶标记试剂相对稳定，且无放射性危害，相对而言，结果更客观，操作快捷、易于自动化［13］。目前临床检测自身免疫肝病抗体的ELISA和免疫印迹法(膜条)的产品之间存在着较大的底物差异，这可能是不同产品之间结果出现差异的原因之一。

2．3免疫印迹膜条法免疫印迹膜条法是通过将特定抗原固化在膜条的特定位置，以待检血清或血浆样品为第一抗体的免疫印迹检测方法。膜条上的抗原多为重组蛋白质，经亲和层析分离纯化，部分抗原为合成多肽。因为抗原纯度较高，免疫反应特异性也较强。由于可在膜条的不同位置分别固化不同特定抗原，可同时实现对多种自身抗体的检测，结果判断也较为简单。目前此方法的大部分实验过程可实现仪器操作，结果的判定也可根据不同公司研发的软件进行自动判断。基于该方法的自身免疫肝病抗体检测膜条已广泛被国内临床实验室所采用。2．4xMAP微珠法自Luminex公司研制出基于两种荧光组合的微珠技术(xMAP)以来，其在临床检测上的应用受到越来越多的重视。微珠制备是通过采用

橘红两色荧光素按比例混合于聚苯乙烯微珠中，产生100种可通过激光识别的荧光微珠。针对不同的荧光微珠耦联特定抗原，结合流式计数，可实现同时针对多种自身抗体的检测。Rouquete等［14］采用这一方法对9种核抗原耦联，实现了对9种不同抗核抗体的检测。目前已有多家公司采用这一技术研发了针对自身免疫性肝病抗体的检测产品。采用xMAP微珠法，由于同时对多种抗体进行分析，抗原抗体交叉反应所造成的假阴性和假阳性结果会比采用单一抗原的ELISA或分别点样的膜条要高。但由于抗原抗体结合过程是在悬液中进行的，比之ELISA和膜条方法，xMAP微珠法的抗原抗体结合更加有效。由于xMAP微珠法检测指标组合的灵活性和多抗体的同时检测，这一方法将会被更多的临床实验室采用。

3自身免疫性肝病抗体检测存在的问题

自身免疫性肝病抗体的检测目前主要存在两大问题。其一就是抗体检测底物的非均一性。以AMA-M2检测产品为例，现有ELISA和膜条印迹法的AMA-M2抗原有组织提取物、PDC-E2全长重组蛋白、PDC-E2的N端重组蛋白、PDC-E2/BCOADC-E2/OGDC-E2N端三联体融合重组蛋白和PDC-E2/BCOADC-E2/OGDC-E2全长重组蛋白混合物。抗gp210抗体检测采用的抗原有来自大肠埃希菌的重组蛋白、昆虫细胞sf9表达的重组蛋白和合成多肽。因抗原不同，检测敏感性和检出率会产生较大差别。自身免疫性肝病自身抗体检测存在的另一主要问题就是缺少统一的检测质控品和阳性对照。1982年美国风湿病协会和美国疾病控制中心通过收集ANA阳性患者血清，建立了5个不同的ANA检测标准品，并在此基础上进一步发展为10个不同的ANA检测血清标准品。这10个血清标准品包括不同的ANA特异性(非变性DNA，SS-A，SS-B，U1-RNP，Sm，Sc1-70和Jo-1)［15］。1988年世界卫生组织和国际免疫学协会联盟(IUIS)开始从患者血清制备了3种ANA标准品，包括WHO66/233(IgG类ANA)和W0/80(抗双链DNA抗体)。目前欧盟的相关机构亦有将少量自身免疫抗体阳性的患者血清用作标准品。所有这些标准品的来源均来自于个别患者血清，数量有限，无法提供给临床实验室用于常规实验室质控。由于缺少统一的标准品和校正品，目前市场上基于ELISA的自身免疫抗体检测产品的标准曲线的校正单纯基于采用调整第二抗体(抗人IgG类抗体)来进行。产品本身的校正各公司均采用任意单位(由于无标准品)，造成结果无法比较。多数试剂盒的阳性对照无明确说明，其来源和性质未知。

4结语

自身免疫性肝病是一类慢性进展性疾病，严重影响患者肝脏功能，目前不可治愈，因此早期诊断和药物干预对控制疾病的发展极为重要。相关自身抗体的检查在自身免疫性肝病的诊断上尤为重要。今后几年的发展重点将会针对相关抗体检测的标准化研究和检测质控品的开发。

作者：刘向东单位：东南大学生命科学研究院