嗜吞噬细胞无形体的分子检测范文

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《临床检验杂志》2014年第六期

1诊断方法

1．1形态学诊断AP感染人和易感动物后，主要侵染成熟或未成熟的髓系白细胞。取可疑患者末梢血作厚、薄血涂片，经吉姆萨染色，于中性粒细胞胞浆内发现多个无形体紧密堆积在一起形成桑葚样包涵体(morulaeelementarybody)可支持诊断。形态学诊断方法对采血时间要求严格，且诊断者要有较丰富的看片经验，否则容易发生漏诊和误诊。

1．2血清学诊断通过检测患者血清中抗AP的IgM和IgG类抗体水平及升高程度，可特异性诊断HGA。常用方法为间接免疫荧光(immunofluorescenceassays，IFA)法。采集急性期(发热初期，一般发病1周内)与恢复期(至少间隔2～3周)双份血清。如恢复期血清抗体检测阴性，应建议医生采集第3份血液样本(间隔2～4周)。如果同时检测双份血清，IgG抗体4倍升高，则结果强烈支持AP感染。如果急性期抗体升高，而恢复期没有升高或轻微升高，则应采集第3份血液样本(间隔2～4周)进行进一步检测。血清学诊断方法准确，特异性高，但由于抗体出现较晚，诊断所需时间较长，故血清学检测无法在早期对HGA进行诊断［3］。

1．3分离培养病原体多用人白血病细胞系HL60进行AP的分离培养。最常用的分离方法是将白细胞部分接种培养基，然后将100～500μL抗凝血接种到2×105或1×106个悬浮细胞内，每2～3d染色检查包涵体，一般5～10d可查见包涵体。从患者血标本中分离AP是确诊该病最可靠的方法，但细胞培养分离AP方法复杂和耗时，而且成功率不高。最终确认依然需要检测AP特异性核酸。

1．4分子检测方法AP感染可通过检测AP的DNA进行诊断，AP的分子生物检测方法可用于感染急性期的诊断，或用于后期病原体培养物的鉴定。分子检测诊断方法具有较高敏感性、特异性和可重复性，而且诊断快速、操作简单。

2AP分子检测技术

AP分子检测技术可用于对可疑患者血清样本进行检测，亦可对细胞培养后血细胞标本进行检测，同时也用于AP传播媒介－蜱的基因分子检测和分类。AP的基因组由单股环状染色体构成，长度为1471282bp，G+C百分比为41．6%，含有1369个开放读码框(ORF)。其特征性基因为外膜蛋白(majorsurfaceprotein，msp)以及ankA基因，100%的菌株具有msp2基因，70%的菌株具有ankA基因。目前AP分子检测常用的目标包括编码16SrRNA、热激蛋白(heat-shockprotein，groESL)、msp蛋白、AnkA蛋白等的基因。16SrRNA高度保守，是PCR检测最常扩增的靶基因，热激蛋白基因groESL扩增虽不如16SrRNA应用广泛，但groESL基因在不同种属间具有较大的变异性，因此，对于诊断及菌株的鉴定有重要意义;msp编码AP特征性外膜蛋白，这种蛋白质主要介导AP与不同宿主细胞间相互作用，并保证AP能更快地进入宿主细胞内。由于AP的宿主范围很广，包括多种脊椎动物和非脊椎动物，所以msp在不同来源的AP之间差异性大。其中msp2作为AP主要特征性外膜蛋白，已作为诊断AP感染的指征;ankA编码的锚定蛋白能够介导蛋白与蛋白之间的作用，因此AnkA在不同宿主间表现出多样性［5］。目前ank基因鉴定通常用于msp2阳性病例基础上，进行种属分型［6］。AP感染的分子生物学诊断方法主要包括巢式PCR(nestedPCR)、实时定量荧光PCR(realtimePCR)和环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等。PCR和PCR相关检测技术是诊断AP感染的常规方法，目标基因与PCR引物见表1。

2．1巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是一种变异的PCR，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因其在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增产物。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异性，通常采用属特异和种特异引物同时进行检测。PCR检测应分区进行，避免污染。16SrRNA高度保守，是巢式PCR检测AP最常扩增的靶基因。由于AP的地域分布范围广，且有高度的生物学和临床学多样性，在比较不同地域发现的AP时最常用的方法就是巢式PCR。例如在波罗地海与挪威发现的AP比较研究就是用巢式PCR对16SrRNA和msp4进行测序分析［16］。Wuri-tu等用巢式PCR比较日本发现的AP与美国和欧洲AP的P44/msp2基因结构。热激蛋白基因groESL扩增虽不如16SrRNA应用广泛，但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。Adrian等［17］通过巢式PCR鉴定和比对不同国家野生动物体内AP的groEL不同，鉴定出新的菌株。因此，对于诊断及菌株的鉴定，groEL基因有重要意义。Massung等［18］在对ank基因鉴定并对AP进行种属分型时也应用该种方法。

2．2实时定量荧光PCR(realtimePCR)实时定量荧光PCR是将荧光共振能量传递现象、光学技术与常规PCR结合的一种PCR检测技术。即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，在PCR指数扩增期间通过连续检测荧光信号的强弱来实时测定特异性产物的量，从而实现核酸的精确定量，最后通过标准曲线对目的基因的初始量进行总量分析。由于实时荧光定量PCR仪自动化程度高，因此比常规PCR特异性更强且有效解决了常规PCR的污染问题。常用方法有SYBRgreen法和探针法(TaqManprobe)。Klaus-Peter等［10］将荧光染料掺入法(SYBRgreen)用于AP的抗生素药物敏感性研究中。Joshua等［14］的研究中用探针法来鉴定AP和伯氏疏螺旋体。

2．3环介导等温扩增技术(LAMP)环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种2000年开始出现的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。其特点是针对靶基因的至少6个区域设计至少4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60min即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，操作简单方便。Lei等［15］用LAMP共针对目标基因8个区域设计6种特异性引物，特异性达100%。相比传统PCR技术，LAMP的特点更适合HGA在农村用于早期诊断，有着广泛的应用前景。

3小结与展望

分子生物学诊断AP的方法不仅快速、灵敏、操作简便而且特异性强、重复性好。各种分子检测方法各有优缺点，简要总结如下:巢式PCR用途广泛，错误率低、特异性强但由于需要经过两次扩增且操作中需要开盖处理，因此易污染;实时荧光定量PCR的自动化程度高，特异性强，可进行定量分析，但费用昂贵，对引物特异性要求高;LAMP不需要PCR仪和昂贵的试剂，操作简单方便。更适用于农村早期诊断。AP分子检测技术不仅可用于HGA诊断，亦可对扩增产物进行测序并进行AP同源性比较，分析各地AP流行株、AP地域变异性和不同宿主AP多样性。AP分子生物检测技术也有局限性的一面，仅能判断病原体的有无和拷贝数的多少，难以检测病原体进入体内后机体的反应及其结果。

作者：王峰宝福凯柳爱华单位：昆明医科大学病原生物学与免疫学系热带医学研究所生物化学与分子生物学系