汉族帕金森病伴障碍患者基因研究范文

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《临床检验杂志》2014年第六期

1材料与方法

1．1总RNA的提取和纯化所有研究对象取清晨空腹静脉血8mL，按Histopaque-1077淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)说明书操作提取各样本的外周血单个核细胞(PBMC)，实验在4h内完成。用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，用氯仿抽提、异丙醇沉淀RNA，70%乙醇洗涤2次，无RNase水溶解沉淀。取2μL样本用Agilent2100Bioanalyzer芯片分析系统(美国AgilentTechnologies公司)定量检测以评估总RNA，取28S/18S≥1．0、吸光度(A260/230nm)≥1．0、A260/280nm≥1．8的样本用于后续实验。

1．2芯片检测以200ngRNA为模板，按照Illu-minaTotalPrepRNA扩增试剂盒(美国Ambion公司)说明书操作将RNA逆转录成cDNA，并进行cDNA合成及纯化，由上海晶能公司完成。取1．5μgcDNA、10μL无RNase水(美国Ambion公司)及20μLGEX-HBY杂交液(Illumina芯片配套试剂，美国Illumina公司)于杂交管中混匀后，取30μL样品加入HumanHT-12v4ExpressionBeadChip芯片(美国Illumina公司)中，在杂交槽中58℃杂交14～20h。最后在250mLE1BC溶液(Illumina芯片配套试剂，美国Illumina公司)55℃洗涤10min，室温洗涤5min。用IlluminaBeadChipReader系统(美国Illumi-na公司)读取及获取图像，然后对数据进行标准化处理(IlluminaGenomeStudioSoftware，Illumina基因组工作室应用程序，www．illumina．com．cn/soft-ware/genomestudio_software．aspx)，用R软件(美国LucentTechnologies公司，www．r-project．org)进行t检验计算P值，以P＜0．05为标准筛选差异基因。同时以Illumina自行开发的算法IlluminaCustom(supportres．illumina．com/documents/myillumi-na/c94519f7-9348-4308-a32f-b66ff3959e99/genomestu-dio_gx_module_v1．0_ug_11319121_reva．pdf)计算出每个基因的表达倍数值(foldchange，FC)，FC≥2倍表示该基因表达上调，FC＜2倍表示该基因表达下调，筛选出在PD-CI患者和体检健康者外周血差异表达的基因。KEGGpathway富集度分析:将全部基因/转录本作为背景列表，差异基因/转录本列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用超几何分布计算差异基因/转录本列表中的富集指数(foldenrichment，FE)，以P＜0．05为标准筛查前10名的KEGGpathway。实验由上海晶能公司完成。

1．3RT-PCR验证芯片结果根据芯片数据结果，选取与疾病有关的差异表达基因并设计引物，引物由上海晶能公司设计，上海捷瑞公司合成。ABCA1(AF275948)上游引物序列:5''''-GACATCTTTCTGCGGGTGAT-3''''，下游引物序列:5''''-AGGACGTAGGGCAGGTACAG-3''''，产物片段大小为401bp;β-actin(BC002409)上游引物序列:5''''-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3''''，下游引物序列:5''''-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3''''，产物片段大小为564bp。以3例PD-CI患者和体检健康者的总RNA为模板，用Fun-glynFTC-3000实时荧光定量PCR仪(加拿大Fung-lynBiotech公司)对芯片筛选结果进行验证，PCR总反应体系为25μL，包括12．5μL2×QuantiFastSYBRGreenPCRmastermix(美国Qiagen公司)，10μmol/L上、下游引物各1．25μL，cDNA2．5μL，无RNAase水5．0μL。PCR循环参数:95℃5min;95℃10s，59℃(ABCA1)/60℃(β-actin)30s，共40个循环。实验重复3次。将与芯片结果一致的差异基因在其余35例汉族PD-CI患者与47例体检健康者中进行RT-PCR验证，步骤同上。实验重复3次。结果用2－△△Ct法计算。

1．4统计学分析采用SPSS18．0统计软件进行。符合正态分布的数据以x珋±s表示，两组间比较用t检验。不符合正态分布的数据采用成组设计资料的秩和检验，以P＜0．05为有统计学意义。

2结果

2．1MMSE评估结果3例PD-CI患者和3例体检健康者均具有初中以上文化程度，根据MMSE评估标准显示，3例PD-CI患者都有中度的认知功能障碍，体检健康者无认知障碍，见表1。

2．2差异基因聚类分析结果PD-CI组与健康对照组相比，基因芯片数据的聚类分析发现176个基因差异表达达到2倍以上，其中有68种基因上调，108种下调。部分差异基因结果如图1所示。

2．3KEGGpathway富集度分析结果显示，PD-CI组与健康对照组比较，10个具有统计学差异的KEGGpathway分别是胆碱能突触(FE=5．569，P=0．005)、小细胞肺癌(FE=5．307，P=0．018)、癌症的转录失调(FE=3．807，P=0．018)、GABA能突触(FE=5．185，P=0．019)、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢(FE=50．125，P=0．020)、昼夜节律(FE=4．904，P=0．022)、趋化因子信号传导通路(FE=3．342，P=0．028)、谷氨酸突触(FE=4．064，P=0．035)、多巴胺突触(FE=3．638，P=0．046)、精氨酸和脯氨酸代谢(FE=5．569，P=0．049)。其中多巴胺和胆碱能突触涉及PD-CI的机制，KEGGpath-way的富集度分析结果显示，二者的FE分别为3．638、5．569，PD-CI组与健康对照组相比，差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．4实时荧光定量RT-PCR检测结果3例PD-CI和3例健康对照的2－△△Ct值分别为(0．125±0．028)和(1．969±0．381)，秩和检验结果显示，ABCA1基因表达下调(Z=－1．964，P=0．050)，与芯片结果基本一致，说明基因芯片结果可靠。而对35例PD-CI患者和47例健康对照者样品RNA进行实时荧光定量RT-PCR，其2－△△Ct值分别为(0．828±0．327)和(1．055±0．259)，结果显示其目的基因表达差异有统计学意义(Z=－2．742，P=0．006)。

3讨论

本研究利用基因芯片筛查新疆地区汉族PD-CI患者与体检健康者外周血表达差异基因。与体检健康者相比，PD-CI患者外周血中表达差异2倍以上的基因共176条，其中表达上调68条，表达下调108条，这些差异基因主要涉及炎症反应、免疫反应、防御反应、创伤反应、外部刺激反应等功能。首先，本研究中多巴胺突触通路异常(FE=3．638，P=0．046)与PD的病理基础多巴胺代谢紊乱一致，中脑黑质区多巴胺突触的功能障碍不仅影响多巴胺的分泌和再摄取，而且额叶、纹状体以及海马旁回的多巴胺突触缺陷也可能与记忆力、注意力减退及执行功能受损有关。其次，在本研究中PD-CI患者的胆碱能突触相关pathway的异常在KEGG富集分析中最为显著(FE=5．569，P=0．005)。

病理学研究证实，α-突触核蛋白以及tau蛋白在胆碱能突触的异常聚集可诱导海马旁回胆碱能细胞的凋亡。而我们的研究进一步证实了PD-CI也存在胆碱能突触的功能障碍，与Hilker等研究结果相吻合。相关研究也提示PD-CI患者皮质下和皮质区域内胆碱受体的减少与认知功能或抑郁症状的严重程度相关。其他信号通路研究方面，6-羟基多巴胺(6-OHDA)对黑质多巴胺能神经元亦具有选择性毒性作用，可以导致纹状体几乎所有的多巴胺丢失，以及与黑质纹状体多巴胺传输有关的谷氨酸能和GABA通路调节有关的基因表达改变。这些改变可能是纹状体多巴胺水平降低的代偿效应，这与本研究GABA能突触、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢异常相符(FE=5．185，P=0．019;FE=50．125，P=0．020)。而小细胞肺癌、癌症的转录失调可能与多巴胺神经元的丢失存在共同的凋亡路径有关。基因芯片结果提示，176个基因表达差异达到2倍以上，其中ABCA1基因表达下调，其编码的是一种跨膜转运蛋白，通过在细胞膜上形成一种依赖ATP酶的通道介导细胞内的游离胆固醇和磷脂等成分的转运，对大脑中胆固醇的摄取与转运、apoE的脂化、神经元膜结构和功能、胆碱能突触的数量和功能以及神经炎性斑块的发生、认知功能的衰退等均产生重要影响。

ABCA1基因敲除小鼠与正常对照鼠相比，其学习能力和记忆水平明显下降，可能与ABCA1表达下降导致β-淀粉样蛋白寡聚物异常沉积在海马有关。本研究中RT-PCR结果提示，35例PD-CI患者差异基因ABCA1的表达低于47例健康对照者(Z=－2．742，P=0．006)。结合胆碱能突触异常的KEGG富集分析，提示PD-CI可影响血液中ABCA1基因的表达，而该基因的表达下降可能与PD患者认知功能的损害有关。这也与Pahnke等的研究结果相符。然而本研究仅仅从ABCA1mRNA表达水平揭示其表达异常可能是PD-CI的一个潜在的生物标志物，该基因引起PD-CI的具体分子机制尚需进一步研究。

作者：罗琴夏欢杨新玲单位：新疆医科大学附属肿瘤医院干部病房科