慢病毒介导的胶质瘤模型应用范文

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《解剖学报》2016年第二期

［摘要］

目的比较移植性肿瘤动物模型与慢病毒介导的胶质瘤模型在教学中的应用效果。方法选取50名临床8年制5年级学生，根据不同的实验操作，将学生随机分为移植性肿瘤动物模型组(n=25)以及慢病毒介导的胶质瘤模型组(n=25)。移植性肿瘤动物模型组以大鼠胶质瘤细胞系9L脑纹状体注射Wistar大鼠模型进行实验操作;而慢病毒介导的胶质瘤模型组则以慢病毒载体介导Ras的表达以及Akt的激活，注射胶质纤维酸性蛋白(GFAP)-Cre基因小鼠进行实验操作。教学结束后比较两组的教学反馈和教学成果。结果与移植性肿瘤动物模型组相比，慢病毒介导的胶质瘤模型组成员对该模型的教学反馈评价更高，该模型的重复性更好，使学生对肿瘤分子水平的认识更深入，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论慢病毒介导的胶质瘤模型在教学中应用具有可行性，不仅提供了一个较新的模型，也使得学生能够从分子水平认识肿瘤，对于肿瘤的理解更为深入。

［关键词］

慢病毒介导的胶质瘤模型;转基因型脑胶质瘤模型;移植脑胶质瘤模型;教学;学生

神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半。由于其临床治疗效果不佳，预后性差等因素的影响，神经胶质瘤成为中枢神经脑肿瘤中发病率最高的原发性肿瘤。根据世界卫生组织的分类系统，脑胶质瘤根据其恶性程度可分为4个等级。其中Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤恶性程度很高，患者的平均存活时间仅为1年。因此，建立稳定、可靠、易重复的胶质瘤动物模型，通过模型研究胶质瘤的发病机制，找出合理的治疗方案非常必要。目前，胶质瘤动物模型可分为诱发性脑胶质瘤模型、移植脑胶质瘤模型和转基因型脑胶质瘤模型3种。其中转基因型脑胶质瘤模型的建立是基于人们对癌基因激活以及抑癌基因失活等认识不断加深，以及转基因和基因剔除技术的发展，是3种方法中最新的一种。该方法相比于另两种方法，具有多种优势:建立的系统更加稳定;重复性好;分子机制清楚。我们通过比较慢病毒介导的转基因型胶质瘤模型［1］以及目前应用最多的移植脑胶质瘤模型在教学中的反馈评价，分析慢病毒介导的转基因型胶质瘤模型是否适合作为教学模型，以及它作为教学模型的意义。

一、对象和方法

随机抽取临床8年制5年级学生(n=50)作为实验操作者，根据不同的操作，将学生分为实验组和对照组。实验组为慢病毒介导的转基因型胶质瘤模型组，对照组为移植脑胶质瘤模型组，每组25人，两组学生随机分组，年龄、相关基础知识以及智力水平相当。实验动物由上海交通大学医学院实验动物科学部提供，动物合格证号:［2012］038。2．操作方法实验操作前由教师讲解实验所需的材料以及实验中的注意事项，着重向学生阐明选择的模型的发展背景，使学生对实验材料有所认识。实验组学生使用慢病毒载体使Ras表达或Akt激活，由于它们的表达受到Cre重组酶的控制，因此通过将病毒注入胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)-CreTp53+/－基因小鼠海马区或脑室下区，可导致胶质瘤的发生。其中GFAP-CreTp53+/－小鼠由GFAP-Cre转基因小鼠与Tp53+/－小鼠进行杂交产生肿瘤抑制子(tumorsuppressor，Tp53)，8～16周鼠龄时用于实验。使用氯胺酮麻醉小鼠，将少量的病毒(0.8μl，1×108IU)立体定位注射入小鼠。TomoH-RasV12lentiviralvectors和TomoAKTlentiviralvectors以1∶1混合注射。在注射后观察小鼠的生存状态，行为状态以及体重的变化。观察瘤的大小以及成瘤情况，并且进行病理组织学检查。对照组学生使用大鼠胶质瘤细胞系9L脑纹状体注射Wistar大鼠［2］，之后采取与实验组相似的方法观察大鼠生存以及行为状态，观察成瘤情况以及病理组织学检查等。完成所有实验后所有学生各自撰写实验报告，报告内容除了包括实验目的、操作步骤等，需要着重撰写:(1)实验中出现的困难;(2)实验后对于胶质瘤发生的认识。3．评价方法3.1统计实验结果中成瘤大小、成瘤率。3.2课堂观察的方法:以学生上课时的关注情况，对于课堂问题的参与应答情况作为评价的因素。3.3课后撰写实验报告的结果作为评价的因素3.4问卷调查:实验教学结束以后，通过教学效果问卷对两组学生进行调查，调查内容包括对该模型的认识以及对胶质瘤的认识程度等。4．统计学方法采用t检验比较两组之间的差异，P＜0.05为差异有显著性。

二、结果

1．两组模型成瘤情况比较两组模型的成瘤率都是100%，说明建立这两种模型都可以用来成瘤，但实验组形成的肿瘤大小更均一，而对照组肿瘤出现了较大或较小的现象。2．两组学生课堂参与情况的比较两组学生的上课关注情况被总结于表1中，通过比较可以看出两组学生上课都很认真，并且积极参与讨论，与教师形成互动。3．实验报告的撰写结果从实验报告的得分上看(表2)，实验组学生的成绩更高一些，主要原因是该组学生对于胶质瘤的认识更深入，对胶质瘤的了解从宏观到微观都较对照组清晰。有多位对照组的学生都提到这种移植的方法的遗传背景不清楚，这使得学生不能很好地理解胶质瘤形成原因。而实验组在授课时教师就可以很清晰的阐明肿瘤的发生是由于癌基因的激活或者抑癌基因的失活所致，实验中设计的材料也涉及到癌症中一些信号通路的激活等分子方面的知识，这些都使得学生能够很好地理解实验安排的原因，将理论与实践相结合。更有一些同学在报告中指出，其他已知的一些重要的癌基因也可以通过慢病毒介导在细胞中表达等，做到了举一反三，说明慢病毒介导的胶质瘤模型使用更为灵活。4．问卷调查结果与分析通过比较两组学生的问卷，学生对实验本身的感兴趣程度基本相似，但实验组学生对实验设计的理解更为清楚，知道为什么会选择相关基因的表达，为什么选择GFAP-CreTp53+/－基因小鼠。对实验的因果由来了解都较清楚。相反，对照组的学生由于该模型自身的局限性，不能清楚知道其遗传背景，对胶质瘤的认识不够深入全面。学生问卷调查表明:慢病毒介导的胶质瘤模型能更好地提高学生的学习兴趣、自学能力、学习主动性和独立性，加强学生对理论知识的理解，提高学生临床技能、临床思维能力和综合能力。慢病毒介导的胶质瘤模型更为学生所接受和喜爱，慢病毒介导的胶质瘤模型在激发学生学习兴趣，提高学生主动性，加深课堂知识理解和知识的长期记忆上效果尤著，两组比较差异有统计学意义。

三、讨论

通过上述两组的比较，我们发现实验组学生与对照组学生对实验本身的接受情况是类似的，但实验组学生通过该实验课对胶质瘤的认识更为深入，从分子水平上解释了肿瘤的发生，这也是转基因胶质瘤模型优于移植型胶质瘤模型的地方。染色体畸变、碱基缺失或突变，或者肿瘤相关基因表观修饰改变是肿瘤发生的主要原因［4］。许多胶质瘤患者的肿瘤组织中存在PTK/Ras/PI3K、p53和Rb等基因的突变，其中p53、pTen、EGFR、CDKN2A/2B和NF-1是突变频率最高的基因。胶质瘤的形成是一个多因子、多种生物学行为的过程，包括某些通路异常激活、细胞周期被破坏等［5］。利用外源性方法模拟某种肿瘤形成过程就可以建立相应的动物模型［6］。实验组选取的小鼠是GFAP-CreTp53+/－基因重组小鼠，肿瘤抑制因子Tp53的突变有利于肿瘤的发生［7］。通过转导慢病毒促进Ras［8］以及Akt［9，10］的表达也进一步促进了肿瘤的发生。正是由于这些基因突变的发现，为建立转基因胶质瘤动物模型提供了重要的基础。同时慢病毒介导的胶质瘤动物模型，载体容易构建，表达系统稳定，免疫原性较小。最重要的是，在使用该方法时，可以根据实际情况调整相关基因，通过促进其他单一或多个癌基因的表达，检测成瘤率，因而非常灵活也更加实用。本研究表明，慢病毒介导的胶质瘤动物模型分子机制更为明确，能够更清楚地从分子水平解释肿瘤发生的原因，使学生对于胶质瘤的发生有进一步的认识，因此适合作为教学模型推广使用。

作者：宋大勇 李志强 权哲 赵军 张宁 许大远 单位：上海交通大学附属第六人民医院南院