辣椒素对大鼠肝脏损伤作用保护分析范文
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［摘要］目的研究辣椒素对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响，并初步探讨保护作用的潜在机制。方法将30只健康雄性SD大鼠随机均分为空白对照组、模型组、辣椒素组，用无创血管夹夹闭大鼠左、中叶肝蒂建立70％肝脏缺血再灌注损伤模型。ELISA法检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）水平；HE染色检测肝脏病理形态；蛋白免疫印迹法检测肝脏BCL－2、Bax、BCL－XL、激活性Caspase3（C－Caspase3）、ERK和p－ERK水平；TUNEL检测肝脏细胞凋亡。结果与空白对照组相比，模型组ALT、AST、LDH、Bax、C－Caspase3、p－ERK和TUNEL水平明显增高，而BCL－2和BCL－XL降低，肝组织病理改变明显增加，ERK水平无差异；与模型组相比，辣椒素组ALT、AST、LDH、Bax、C－Caspase3、p－ERK和TUNEL水平明显降低，而BCL－2和BCL－XL表达增高，肝组织病理改变明显减少。结论辣椒素对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，其作用机制可能与抑制ERK磷酸化，减轻细胞凋亡相关。
［关键词］辣椒素；肝脏缺血再灌注损伤；细胞凋亡；大鼠
肝脏缺血再灌注损伤（ischemiareperfusionin－jury，IRI）常出现在心脏体外大循环、肝叶切除、肝移植等手术过程中，是导致肝功受损，乃至肝功衰竭的重要病因。减轻肝脏IRI目前是临床研究的难点和热点［1，2］。在肝脏IRI中，涉及多条信号途径和多种细胞因子。有研究显示MAPKs信号途径在肝脏IRI被活化激活，ERK信号途径系MAPKs家族的重要成员之一，可被缺血，感染等有害刺激通过磷酸化途径激活，进而引发细胞凋亡和坏死等［3］。目前有实验显示抑制ERK信号途径激活可减轻IRI。辣椒素是从辣椒萃取的主要单体，是瞬时感受器电位香草酸受体－1（Transientreceptorpotentialvanilloid－1，TRPV1）的激动剂，具有防治心脑血管疾病，调节免疫，对肺和心脏IRI具有保护作用［4－6］，但对肝脏IRI研究较少，其作用途径是否与ERK－MAPK信号途径相关尚需进一步探索。本研究拟探讨辣椒素对肝脏IRI的保护作用及其与ERK－MAPK信号途径的关系。
1材料与方法
1．1动物
SPF级雄性健康SD大鼠30只，体质量195～245g，购买于四川大学实验动物中心，动物合格证号：SCXL（川）2014－011。
1．2试药和仪器
辣椒素（Sigma，USA），TUNEL检测试剂盒、水合氯醛（均为武汉谷歌），ERK、p－ERK、BCL－2、Bax、BCL－XL、C－Caspase3检测试剂盒（均为USA，CST）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（均为南京建成科技公司），BX51显微镜（Olympus）、成像系统（HITMAS公司）。
1．3分组和建模
30只SD大鼠随机均分为空白对照组、模型组、辣椒素组，每组10只。辣椒素组术前30min给予辣椒素（8μg•kg－1）腹腔注射，剂量参考文献［7］。空白对照组和模型组术前30min给予等量生理氯化钠腹腔注射。模型组和辣椒素组参考文献［8］施予肝脏IRI手术，用无创血管钳夹闭肝左叶与中叶的血管与胆管造成肝脏70％的缺血，同时保留肝右叶与尾状叶的血供，阻断后可见被阻断区肝叶颜色由鲜红色变为暗红色表明肝脏缺血成功，60min后取下无创血管夹恢复肝脏血供。空白对照组操作同上，但不夹闭肝左叶与中叶的血管，无菌手术缝合大鼠腹部切口，敷料包扎。
1．4标本处理
大鼠施予肝脏IRI手术2h后，收集血清和肝脏标本，血清室温下3000r•min－1离心10min后，收集上清液，部分送仁和医院检验科检测ALT、AST和LDH水平。1／3肝脏置于多聚甲醛固定，其余肝脏－80℃冰箱冻存。
1．5肝脏病理形态检测
取肝脏蜡块4μm切片，脱蜡透明后由病理科实验室行HE染色，显微镜下观察肝组织的形态学变化并评分。分级评分标准［8］：损伤＜10％，病理评分为0分；损伤10％～25％，病理评分为1分；损伤25％～50％，病理评分为2分；损伤50％～75％，病理评分为3分；损伤75％～100％，病理评分为4分。
1．6蛋白免疫印迹法检测蛋白水平
取大鼠肝脏50mg置于匀浆器内，加入RIPA和磷酸酶抑制剂，冰上均匀研磨，裂解30min，12000r•min－1离心，取等体积100μl上清液，BCA法测定蛋白浓度，完毕后裂解液稀释蛋白到等浓度，后5×SDS，水浴煮沸变性10min，置于－80℃冰箱备用。根据蛋白分子量制备不同浓度胶，上样，电泳80V电压30min，120V电压60min。转膜，封闭2h（脱脂奶粉），TBST洗膜3次，每次5min。脱脂奶粉稀释液稀释一抗ERK（1∶500）、p－ERK（1∶1000）、BCL－2（1∶400）、Bax（1∶500）、BCL－XL（1∶500）、C－Caspase3（1∶400）和β－actin（1∶4000），4℃冰箱孵育PVDF膜过夜，TBST洗膜3次，每次5min。孵育脱脂奶粉稀释配制的HRP标记的二抗IgG（1∶400），37℃振荡孵育膜1h。TBST洗膜3次，每次5min，化学发光剂显影，曝光，扫描胶片，ImageG进行图像分析，计算测定蛋白相对水平（目的蛋白条带灰度值／内参β－actin条带灰度值）。
1．7肝细胞凋亡检测
TUNEL检测肝细胞凋亡，具体参考说明书方法。
1．8统计学方法
数据采用SPSS13．0软件进行统计分析，实验结果采用珚x±s表示，资料采用单因素方差分析（ANOVA），多个样本之间的两两比较采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1辣椒素对大鼠血清ALTAST和LDH水平的影响
与空白对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST和LDH水平明显增高（P＜0．05）。与模型组比较，辣椒素组大鼠血清中ALT、AST和LDH水平均明显降低（P＜0．05）。提示辣椒素对肝脏IRI具有一定保护作用，见表1。
2．2辣椒素对大鼠肝组织病理结构的影响
空白对照组肝脏形态结构完整，未见肝细胞坏死，炎症细胞浸润。肝脏IRI模型组可见肝细胞广泛肿胀，变性坏死，肝血窦区和中央静脉广泛淤血肿胀，门管区炎性细胞明显浸润，肝小叶结构明显破坏。辣椒素组偶见部分肝细胞肿胀，坏死，未见片状坏死，少量肝细胞气球样变和门管区散在炎性细胞浸润，与空白对照组相比，辣椒素组肝脏病理形态改变无明显差异，见图1，提示辣椒素可减轻肝脏病理结构改变。图1辣椒素对IRI大鼠肝组织病理结构的影响（HE，×200）
2．3辣椒素对大鼠肝脏BCL－2BCL－XLBax和C－Caspase3水平影响
检测结果显示与空白对照组相比，模型组大鼠肝脏Bax和C－Caspase3蛋白水平明显增高（P＜0．05），而BCL－2和BCL－XL蛋白水平明显降低（P＜0．05）；与模型组相比，辣椒素组大鼠肝脏Bax和C－Caspase3蛋白水平明显降低（P＜0．05），而BCL－2和BCL－XL蛋白水平明显增高（P＜0．05）。提示辣椒素可抑制凋亡信号通路激活，见图2。
2．4辣椒素对大鼠肝组织ERK和p－ERK蛋白水平影响
检测结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠肝组织p－ERK蛋白水平明显增高（P＜0．05），而ERK表达无差异（P＞0．05）；与模型组组相比，辣椒素组大鼠肝组织p－ERK蛋白水平明显降低（P＜0．05），而ERK表达无差异（P＞0．05）。辣椒素组与空白对照组相比无显著性差异（P＞0．05）。提示辣椒素可以抑制ERK信号通路激活，见图3。图3辣椒素对IRI大鼠肝组织p－ERK和ERK蛋白水平影响
2．5辣椒素对大鼠肝细胞凋亡的影响
检测结果显示，与空白对照组相比，模型组肝细胞TUNEL表达明显增加（P＜0．05）；与模型组相比，辣椒素组肝细胞TUNEL表达明显降低（P＜0．05）；提示辣椒素可明显降低肝脏细胞凋亡，见图4。
3讨论
肝脏IRI是临床上常见的病理生理过程，好发于肝移植、肝切除和心脏体外循环手术等过程中，其发病常不可避免，严重影响手术的疗效和患者的预后［1，2］。因此减轻肝脏IRI具有重要的临床应用价值．既往研究显示肝脏IRI的发病机制十分复杂，是一个错综复杂的过程。涉及炎症反应、微循环障碍、钙超载、自由基清除受阻、间质水肿、细胞凋亡和坏死等［9，10］。本实验研究发现，肝脏IRI后，血清中肝脏损伤标记物（ALT、AST和LDH）水平明显增加，肝脏病理损伤明显加重，细胞凋亡标志物TUNEL明显上调，这与既往研究结果相一致，提示肝脏IRI引发的肝脏细胞凋亡是导致肝脏受损的重要通路。因此，阻断或减少肝脏细胞凋亡是防治肝脏IRI的重要途径。既往研究显示，在肝脏IRI过程中，肝脏细胞凋亡受凋亡相关的基因和蛋白严密调控，与细胞凋亡相关的基因大多可分为促凋亡的基因和抗凋亡的基因［9］。BCL－2和BCL－XL是细胞内一对极其重要的抗凋亡基因，而Bax和Bad为Bcl－2家族的成员，其作用与抗凋亡基因BCL－2和BCL－XL完全相反，具有促进细胞凋亡的作用［11］。有研究显示BCL－2和BCL－XL的表达增高以及Bcl－2／Bax，Bcl－2／Bad，Bcl－xl／Bax，Bcl－xl／Bad比值增加可抑制Bax和Bad的活化，从而减轻细胞凋亡［11］。本实验结果证实，应用辣椒素预处理能明显减少血清中肝脏损伤标记物（ALT、AST和LDH）水平和肝脏病理改变，下调TUNEL的表达，增加Bcl－2蛋白水平，减少Bax和Bad蛋白水平，并使Bcl－2／Bax，Bcl－2／Bad，Bcl－xl／Bax，Bcl－xl／Bad比值增加。提示辣椒素能减少IRI引发肝脏细胞的凋亡，且辣椒素的肝脏保护作用与抑制Bcl－2／Bad，Bcl－2／Bax，Bcl－xl／Bax和Bcl－xl／Bad介导的肝脏细胞凋亡密切相关。近来研究发现在肝脏IRI过程中，凋亡相关基因和蛋白的表达、调控与MAPK信号转导途径密切相关［12］。而ERK是MAPK激活途径中极重要的一类［13］。抑制ERK信号途径可减轻肝IRI［13］。本研究结果显示，肝脏IRI组p－ERK表达明显增高，进一步证实了IRI伤刺激可促进ERK信号途径磷酸化激活。而辣椒素预处理，可明显降低ERK的磷酸化水平。结果提示辣椒素可能通过抑制ERK磷酸化促进抗凋亡蛋白BCL－2的表达，而减少促凋亡蛋白Bax和Bax等的表达。综上所述，辣椒素可能通过抗凋亡信号途径减轻肝脏IRI，其作用途径与抑制ERK磷酸化，促进Bcl－27Bad，Bcl－2／Bax，Bcl－xl／Bax和Bcl－xl／Bad比值增加相关。
［参考文献］
［7］秦素兰，刘陕岭，王儒蓉．辣椒素对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究［J］．四川大学学报（医学版），2008，39（4）：550－554
［8］曹晓飞，张峰，张业伟．PPARγ激动剂罗格列酮在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用及机制探讨［J］．南京医科大学学报（自然科学版），2007，27（11）：1271－1273
作者：闫国旗 张凯 宴彩华 王琴 单位：湖北宜昌