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［摘要］目的制备红芪多糖HG－2及建立红芪多糖HG－2的含量测定方法，并联合透明质酸水凝胶测定凝胶时间、释药量、降解及溶胀率等参数。方法采用SephadexG－25纯化制备红芪多糖HG－2，苯酚－硫酸法测定含量，并用化学改性法制备透明质酸（HA）水凝胶，将二者联合制备红芪多糖HG－2HA水凝胶。结果红芪多糖HG－2的含量为95．97％，HA水凝胶的凝胶时间为（180±20）s；溶胀率为42．33％；并在第5天基本降解。红芪多糖HG－2HA水凝胶释药在第120h已趋于平稳，释药量为86．15％。结论选用葡萄糖作为对照品测定红芪多糖HG－2含量的方法简便、准确。红芪多糖HG－2HA水凝胶能够起到缓释作用，二者联用具有可行性，可以为后续动物实验提供理论依据。
［关键词］红芪多糖；SephadexG－25；苯酚－硫酸法；透明质酸水凝胶；释药
红芪（HedysariRadix）为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪（HedysarumpolybotrysHand．－Mazz．）的干燥根。具有固表止汗，补气利尿，托毒敛疮等功效［1］。常用于治疗气虚、多汗、慢性肾炎及心脏病等［2］疾病，效果显著。其中红芪多糖作为红芪药材的主要活性成分，具有抗自由基和抗肿瘤、调节免疫等多种药理作用［3－5］，由5种单糖组成［6－8］。水凝胶为三维网状结构胶体［9］，具有良好的生物相容性［10］，常应用于组织工程材料、药物缓释载体、角膜接触镜材料等［11］，因其独特的性质，日益为科研研究及临床应用所重视。透明质酸（Hyaluronicacid，HA）属酸性黏多糖，首次发现是从牛眼玻璃体中分离得到［12］，并具有改善皮肤代谢、保湿及促进透皮吸收的作用。HA水凝胶是HA与相应交联剂交联制成，其疗效明显延长［13］，在治疗骨关节炎、细胞增殖等方面有广泛应用与研究。该课题前期研究发现红芪多糖对骨关节炎有一定的治疗作用，并且相关研究显示HA水凝胶对骨关节炎有一定的治疗作用，且具有缓释药物的作用。因此本试验分离纯化红芪多糖HG－2并将其包封于HA水凝胶中，考察其凝胶时间、溶胀率、释药量以及酶降解速率等参数，并综合以上相关参数分析其可行性，为后续大鼠骨关节炎的治疗作用提供理论依据。
1材料
1．1仪器
UV－3300型紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司），KERN－ABJ型电子分析天平（上海实验器材有限公司），YLA－2000型真空干燥箱（龙口市先科仪器公司），3K15型低温高速离心机（SIGMA公司），冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。
1．2试药
红芪〔购自甘肃省陇西县首阳镇，经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪（HedysarumpolybotrysHand．－Mazz．）的干燥根〕。木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖对照品（均来自上海源叶生物科技有限公司，批号分别为B21880、B21882、B21893、B21891、BB21931）。过硫酸铵（0．1mol•L－1）、四甲基乙二胺（0．1mol•L－1）（西安义信化工有限公司），其余试剂均为分析纯。
2红芪多糖HG－2的制备及含量测定
2．1红芪多糖的提取
称取500．0g干燥红芪药材，浸泡30min后10倍量水煎煮2次（分别为2h，1h），趁热抽滤提取液并浓缩至一定体积，冷却至室温，浓缩液中加入无水乙醇使其含醇量达到60％，放置24h后抽滤，取沉淀用热水溶解，离心滤过，所得滤液再次醇沉至含醇量达80％，室温静置24h。抽滤，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，待沉淀呈类白色时放入55℃烘箱中烘干即得红芪多糖。
2．2精制红芪多糖
取2．1项下红芪多糖粉末5．0g，溶解并定容至25ml量瓶中，采用水提醇沉使乙醇浓度达到80％，连续沉淀2次，然后抽滤，沉淀物再用无水乙醇、丙酮洗涤至无色，使其在55℃烘箱中烘干，即得精制红芪多糖。
2．3红芪多糖的纯化（脱蛋白）
取红芪多糖10．0g溶解并定容至100ml量瓶中，采用Sevage法，加入同体积的正丁醇－氯仿（1∶4），振荡30min，静置分层，离心除去沉淀，上清液重复操作，直到无明显沉淀，合并上清液后醇沉。沉淀物依次用无水乙醇，丙酮洗涤至无色时，于55℃烘箱中恒温干燥12h，即得脱蛋白红芪多糖。
2．4红芪多糖HG－2的制备
取25．0gSephadexG－25凝胶充分溶胀后装柱。称取脱蛋白红芪多糖2．0g，溶解并定容至50ml量瓶中，微孔滤膜滤过后进样。洗脱剂为蒸馏水，流速：0．8ml•min－1。接样，每3ml为1个样，苯酚－硫酸法跟踪检测，测定吸光度（A）值，并绘制洗脱曲线，见图1。合并主峰流出液，浓缩至一定体积，醇沉至醇浓度为80％，静置24h，抽滤，沉淀物用丙酮脱色，放置55℃恒温干燥箱中12h，即得红芪多糖HG－2。
2．5试验条件的选择
2．5．1最大吸收波长根据紫外分光光谱显示的吸收波长，可得最大吸收波长为490nm。2．5．2对照品取相同浓度的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和红芪多糖HG－2溶液各2．0ml于具塞试管中，共9组。精密移取5％的苯酚溶液1．0ml至具塞试管中，摇匀，迅速滴加浓硫酸5．0ml，分别将其置于0、60、65、70、75、80、85、90、95℃水浴中恒温15min，然后再冷却至室温，分别在490nm处测定A值，双蒸水空白调零，结果见图2。由图2可知（未将0℃A值计入图2，表1中说明k值变化），不同温度下各糖的A值均有所变化。根据图2曲线，将其按照温度分为0～60、60～65、65～70、70～75、75～80、80～85、85～90、90～95共8个梯度，计算各部分曲线的斜率k值，见表1。从表1中可以得出，在75～80℃梯度内葡萄糖与红芪多糖HG－2其k值最接近，说明二者在此温度范围内变化趋势一致，线性关系较好，且二者75℃下A值均高于80℃的A值，因此在苯酚－硫酸法测定红芪多糖HG－2的含量时，选择葡萄糖为对照品，后续水浴温度均选择75℃。
2．6红芪多糖HG－2的含量测定
2．6．1葡萄糖标准曲线的绘制精密称取葡萄糖对照品2．5mg，蒸馏水定容至25ml量瓶中，使其浓度为0．1mg•ml－1的葡萄糖贮备液。精密移取上述贮备液0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2、1．4ml于10ml具塞试管中，适量补水至体积为2ml。苯酚－浓硫酸法处理样品，75℃水浴15min，再冷却至室温，以同样处理的双蒸水为空白进行比色，在490nm处分别测定对照品的A值。以A值为纵坐标，以对应的葡萄糖浓度（mg•ml－1）为横坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线为：Y＝12．254X＋0．0077，r＝0．9982说明多糖浓度在0～0．1mg•ml－1范围内，与A值呈良好的线性关系。2．6．2换算因子精密称取2．2项下精制HPS10．0mg，蒸馏水溶解并定容至25ml量瓶中。精密吸取该溶液0．2ml于具塞试管中，补水至2．0ml，根据上述条件测定A值，并按照以下公式计算换算因子f。f＝W／CD以上计算公式中W为称取的精制HPS的质量（mg）；C为多糖溶液中葡萄糖的浓度（mg•ml－1）；D为多糖的稀释倍数，计算得f＝2．4。2．6．3含量测定精密称取红芪多糖HG－210．0mg，定容至25ml量瓶中。取0．2ml该溶液于10ml具塞试管中，补水至2．0ml，按上述条件测A值并计算。含量（％）＝CDf／W×100％，C为HG－2的浓度（mg•ml－1），D为HG－2的稀释倍数，W为称取的HG－2的质量（mg）。计算得红芪多糖HG－2的含量为95．97％。3红芪多糖HG－2HA水凝胶的参数测定
3．1HA水凝胶的制备
精密称取1．0g透明质酸钠（分子量8万～19万），100ml去离子水充分溶解；加1ml甲基丙烯酸酐，用2mol•L－1的氢氧化钠调pH值并保持pH值在8．0～8．5，反应12h。以上操作全部冰浴进行。然后放入冰箱搅拌12h。将上述反应后的溶液装于透析袋并置于水中，3d氯化钠溶液（0．1mol•L－1），3d超纯水，每天换水4次。透析结束后装入50ml离心管，冷冻干燥即得MeHA（甲基丙烯酸酯化的透明质酸）。精密称取2．0mgMeHA置于1．5ml离心管中，加入160μl蒸馏水充分溶解，加入20μl过硫酸铵贮备液，混匀，再加入20μl四甲基乙二胺贮备液，迅速混匀，凝胶后即得HA水凝胶。
3．2红芪多糖HG－2HA水凝胶的制备
称取52．5mg红芪多糖HG－2，定容至50ml量瓶（1．05mg•ml－1）。精密称取2mgMeHA置于1．5ml离心管中，加入160μl红芪多糖HG－2溶液充分溶解，加入20μl过硫酸铵贮备液，混匀，再加入20μl四甲基乙二胺贮备液，迅速混匀，凝胶后即得红芪多糖HG－2HA水凝胶。
3．3红芪多糖HG－2HA水凝胶相关参数的测定
3．3．1凝胶时间（1）按3．2项下制备红芪多糖HG－2HA水凝胶，迅速混匀后置于37℃水浴并开始计时。（2）间歇性的取出离心管翻转，观察液体是否流动。（3）离心管倒立，轻扣管壁，若其中液体不再往下流时，说明凝胶已经形成，记录凝胶时间。结果表明：凝胶时间为（180±20）s。3．3．2溶胀率（1）待水凝胶凝固成胶体后，称质量为M0。（2）将凝胶保持在37℃恒温PBS水浴溶液中，放置过夜，使其自然溶胀。（3）从PBS中取出水凝胶，用滤纸吸去表面溶液，并再次称质量为M1。（4）溶胀率由公式计算得出：溶胀率（％）＝（M1－M0）／M0×100％。结果表明：水凝胶溶胀率为42．33％。3．3．3红芪多糖HG－2HA水凝胶的释药制备红芪多糖HG－2水凝胶浸泡在4．0mlPBS中，并置于37℃恒温培养摇床中，振荡速率为50r•min－1。在预先选定的时间点（6、24、48、72、120和144h），取出1ml溶液，使用紫外－可见分光光度计检测其在490nm处的吸收强度，通过标准曲线计算溶液中红芪多糖的浓度，绘制曲线。每次取样后，溶液中都加入1ml新配的PBS，以维持总体积恒定。取3个平行样进行测试，数据表示为平均值。释药曲线见图3。由图3可知，随着时间的增加，红芪多糖HG－2的释放量也在不断增加，第5天红芪多糖HG－2的释药量达到86．15％，说明水凝胶对药物起到了缓释作用。3．3．4水凝胶体外酶降解速率测定（1）通过计算水凝胶在酶作用下质量的变化而得。（2）根据水凝胶的化学成分，配制浓度为6μg•ml－1的透明质酸酶（体液中透明质酸酶的浓度约为60ng•ml－1，扩大100倍）。（3）先让水凝胶在PBS溶液中自然溶胀，然后取出称质量得m0。（4）将水凝胶置于37℃透明质酸酶工作液中，每天换1次溶液。（5）根据需要，控制降解时间，1、3、5d，取出凝胶，称质量得m1（m1，多次称质量直到恒定／变化很小）。（6）降解速率通过公式计算得出：质量损失（％）＝（m0－m1）／m0×100％。水凝胶降解速率如图
4.结果表明：
透明质酸水凝胶在第5天已基本降解完全。4讨论本试验采用传统的水提醇沉法得到红芪多糖，并通过脱蛋白、过葡聚糖凝胶柱等方法分离纯化得到红芪多糖HG－2，含量明显提高。在红芪多糖HG－2的制备过程中，样品预处理、柱高、洗脱流速、洗脱剂均为影响因素；如样品用微孔滤膜过滤，凝胶柱一般选择柱高与直径比为20∶1的层析柱，洗脱剂选纯水等。本试验对红芪多糖HG－2的含量测定方法进行研究，选用葡萄糖作对照品，测定其含量的方法简便、可靠。本试验进一步完善了以葡萄糖为对照计算多糖含量，提高了试验的准确性，本试验考察了红芪多糖HG－2与透明质酸水凝胶结合的相关参数，为二者联用提供了理论依据，亦为后续红芪多糖的开发利用奠定基础。
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作者：张䶮 周尚儒 燕玉奎 郭玫 单位：甘肃中医药大学药学院