牡丹果皮黄酮工艺优化及抗氧化性分析范文

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［摘要］目的优化牡丹果皮黄酮提取工艺，并评价其抗氧化活性。方法以凤丹牡丹果皮为试验材料，研究乙醇体积分数、液料比、提取温度、超声功率等4个因素对牡丹果皮黄酮得率的影响，用正交法优化超声提取牡丹果皮黄酮的工艺条件。结果牡丹果皮黄酮的最佳提取工艺组合为乙醇浓度50％、液料比25ml•g－1、提取温度80℃、超声功率700W，黄酮得率1．72％。牡丹果皮黄酮提取物具有较高的清除ABTS自由基、DPPH自由基活性。结论优化的凤丹牡丹果皮黄酮工艺方法简便、得率高，得到的黄酮具有较强的抗氧化活性。

［关键词］凤丹牡丹果皮；黄酮；正交试验；抗氧化活性

牡丹籽油在2011年被认定为新资源食品，凤丹牡丹（PaeoniasuffruticosaFengdan）是榨取牡丹籽油常用的品种之一，随着牡丹籽油的急性肝损伤保护［1］、抗糖尿病［2］、降血脂［3］、降血糖［4］、防晒［5］等保健功效［6－8］逐渐被人们重视，种植面积逐年扩大，其副产物果皮也将大量产生，为果皮资源的再利用提供技术支持是非常迫切的。黄酮是一类具有多种生理活性的生物活性物质，可调节心肌的收缩与舒张功能，可用于心血管病等疾病的预防；增加血管的韧性、降低血液黏稠度、降低体内胆固醇含量，具有预防高血压、中风等疾病的效果［9］。传统的提取黄酮的方法有有机溶剂提取法、碱性水提法等［10］，近些年出现了一些新的提取方法，其中超声提取法的超声场与物质之间会产生空化作用，溶液中会产生共振现象［11］，具有缩短试验操作时间，降低实验成本，使有效成分充分溶出的优势。

1材料与方法

1．1材料与试剂

凤丹牡丹果皮：将2016年8月采收的5年生实生苗凤丹牡丹果皮置于室内阴干，9月于鼓风干燥箱60℃烘干后用旋风磨制粉，过100目筛，所得样品粉末贮于棕色广口瓶密封后置于4℃冰箱中保存备用。芦丁对照品（纯度≥98％，批号：153－18－4）；2，2－连氮－双－（3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸）（ABTS）；1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）（均为上海源叶生物科技有限公司）。无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、过硫酸钾、硝酸铝、过硫酸钾均为分析纯。

1．2试验方法

1．2．1标准曲线的建立参考文献［12］的方法，以芦丁为对照品，精确配制浓度为0．2mg•ml－1的芦丁对照品溶液。精确取0．0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0ml的对照品溶液于25ml量瓶中，各加体积分数为70％的乙醇溶液至10ml，分别加入5％亚硝酸钠溶液0．5ml，混合均匀，室温下静置5min；各加入10％硝酸铝溶液0．5ml，混合均匀，室温下静置6min；再分别加入4％氢氧化钠溶液5ml，混合均匀，用70％乙醇定容至25ml，室温下静置15min，以第1瓶反应液作为空白，于510nm处测其吸光度，将所得结果作标准曲线，以芦丁浓度（X，mg•ml－1）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标。求得回归方程为：Y＝11．479X－0．0056，r＝0．99931．2．2牡丹果皮黄酮的提取取1．0g牡丹果皮粉末加入20ml70％乙醇，用超声萃取器进行提取，将提取液用定量滤纸滤过后，按测定标准曲线的方法测定样品的吸光度（A）值，按照标准曲线计算黄酮得率。重复3次。式中C：提取液中黄酮浓度（mg•ml－1）；V：提取液体积；n：稀释倍数；m：样品质量。1．2．3超声提取工艺条件对黄酮得率的影响取1g样品粉末，以不同体积分数乙醇溶液、不同液料比、不同提取温度和不同超声功率进行提取。将提取液用定量滤纸滤过，测定A值，计算其黄酮得率。重复3次。1．2．4ABTS清除能力测定参考文献［13］方法。称ABTS粉末0．096g，用蒸馏水定容至25ml，称0．3784g过硫酸钾，用蒸馏水定容至10ml，量取5ml的ABTS溶液与88μl的过硫酸钾溶液混合均匀，在室温避光的条件下静置过夜，制成ABTS贮备液，在12～16h之内测定，测定时用无水乙醇稀释，使其在734nm波长下的A值为0．7±0．02。将样品液及抗坏血酸（VC）标准品配制成500、250、125、62．5、31．25、15．375、7．6875μg•ml－1的样品液。分别取各浓度的样品液0．2ml，加入3mlABTS贮备液，充分混合，室温放置20min在波长734nm处测定A值；空白管用蒸馏水替代样品液。以VC为对照。按照以下公式计算清除率。重复3次。1．2．5DPPH自由基清除活性测定参考文献［14］方法。精密取0．0197gDPPH粉末，用无水乙醇定容至250ml，配制成0．2mmol•L－1的DPPH贮备液，0℃保存。将样品液及VC标准品配制成500、250、125、62．5、31．25、15．375、7．688μg•ml－1的样品液。分别取各浓度的样品液0．5ml，加入2．5ml的DPPH贮备液，在28℃恒温水浴锅中反应30min，于波长517nm处测定A值。以VC为对照。计算清除率。重复3次。1．3数据处理用MicrosoftExcel2010将数据进行整理与作图，用SPSS13．0进行统计分析，采用邓肯氏新复极差检验法检验，以P＜0．05为差异显著性标准。

2结果与分析

2．1单因素试验结果与分析

2．1．1乙醇体积分数对黄酮得率的影响在液料比20ml•g－1，提取温度60℃，超声功率400W，提取时间40min的条件下，考察乙醇体积分数为50％、60％、70％、80％、90％时对黄酮得率的影响。由试验结果可知，乙醇体积分数在50％～60％时，黄酮得率随乙醇体积分数的增加而升高，在乙醇体积分数为60％时得率达到最大，黄酮得率为1．35％，显著高于其他处理的黄酮得率（P＜0．05）；当乙醇体积分数超过60％时黄酮得率又逐渐降低，可能由于乙醇浓度较低时，有效成分没能充分溶出，而当乙醇浓度在60％以上时，由于乙醇浓度的增大会提高黄酮类化合物的溶解度，但高浓度的乙醇反而会使细胞内蛋白质凝固，导致黄酮不易溶出［15］。2．1．2液料比对黄酮得率的影响在乙醇体积分数70％，提取温度60℃，超声功率400W，提取时间40min的条件下，考察液料比为5、10、15、20、25、30ml•g－1时对黄酮得率的影响。由试验结果可知，随着液料比的增加，黄酮得率不断增大，这是因为随着液料比的增大，浓度差提高，有利于传质，提取越来越充分，但当液料比大于20ml•g－1时，黄酮得率逐渐减少，这是因为当提取溶剂量变大时，黄酮的溶出已趋于达到平衡，再增加溶剂量，提取效果并不能明显提高，同时由于溶剂体积的增大，使得一些非黄酮类的化合物溶解度增大，与黄酮类化合物形成了一定的竞争关系，从而导致提取含量减少［16］，为了减少后续提纯操作中去除溶剂的难度，本试验采用液料比15、20、25ml•g－13个水平进行正交试验。2．1．3提取温度对黄酮得率的影响在液料比20ml•g－1，乙醇体积分数70％，超声功率400W，超声提取时间40min的条件下，考察提取温度30、40、50、60、70、80℃时对黄酮得率的影响。由试验结果可知，当超声提取温度在30～70℃时，黄酮的得率逐渐增大，这可能是由于升高提取温度导致果皮粉末中的物质溶出速度加快；当提取温度为70℃时，黄酮得率达到最大，为1．228％，显著高于其他处理的黄酮得率（P＜0．05）；当温度超过70℃时黄酮得率有所减小，这可能是由于温度过高，其中的有效成分的结构受到了破坏，造成得率的降低。2．1．4超声功率对黄酮得率的影响在液料比20ml•g－1，乙醇体积分数70％，超声提取温度60℃，超声提取时间40min的条件下，考察超声功率为200、300、400、500、600、700、800W时对黄酮得率的影响。由试验结果可知，超声功率在200～600W之间，随着超声功率的增大超声对细胞壁的损坏作用逐渐加强，细胞内有效物质的溶出速度增大，从而使黄酮的得率增大；当超声功率为600W的时候，黄酮的得率达到最大，为1．221％，显著高于其他处理的黄酮得率（P＜0．05）；当再增大超声功率时黄酮的得率开始逐渐减小，这可能是由于过强的超声对黄酮类化合物造成了一定的破坏，黄酮得率下降。

2．2超声提取牡丹果皮黄酮正交试验结果与分析

方案设计与试验结果见表1、2。由表2可以看出，在所选取得的4个单因素内，极差的大小顺序为B＞C＞A＞D；其中因素B的极差最大，说明了单因素B即液料比的变化，对提取黄酮的影响最大。正交试验方差分析结果见表3，由表3可知，乙醇体积分数、液料比、提取温度、超声功率4个试验因素均达到显著水平（P＜0．05），表明试验中乙醇体积分数、液料比、提取温度、超声功率均显著地影响黄酮得率（P＜0．05）。

2．3验证试验

经极差分析可知，当组合为A1B3C3D3，即乙醇体积分数为50％，液料比为25ml•g－1，超声提取温度为80℃，超声功率为700W的条件下，超声提取40min时，凤丹牡丹果皮黄酮得率将达到最大。按此工艺条件进行3次重复验证试验，得出最优组合提取条件下的黄酮得率为（1．72±0．01）％。

2．4牡丹果皮黄酮提取物对自由基的清除作用

2．4．1牡丹果皮黄酮提取物对ABTS自由基的清除能力由图1可知，牡丹果皮黄酮提取物和VC的抗氧化能力均随着浓度的增加抗氧化效果越来越强。在试验条件下，当牡丹果皮黄酮提取物浓度在250μg•ml－1和VC浓度为125μg•ml－1时清除率均达到了100％，黄酮提取物的IC50为13．151μg•ml－1，VC的IC50为5．256μg•ml－1。试验结果表明牡丹果皮黄酮提取物对ABTS具有良好的清除效果。2．4．2牡丹果皮黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力从图2可知，牡丹果皮黄酮提取物对DPPH有明显的清除作用，并且随黄酮提取物浓度的增加，其清除能力逐渐加强，表明牡丹果皮黄酮提取物对DPPH的清除能力与其浓度有着明显的量效关系。在试验条件下，当黄酮提取物浓度在500μg•ml－1时对DPPH的清除率达到了77．086％，其IC50为8．197μg•ml－1，VC的IC50为2．620μg•ml－1。结果表明牡丹果皮黄酮提取物对DPPH自由基具有明显的清除作用。

3讨论

用超声提取凤丹牡丹果皮黄酮类化合物，考察了乙醇体积分数、液料比、提取温度和超声功率4个因素对果皮黄酮得率的影响。通过正交试验对超声辅助提取工艺进行优化，得出最佳工艺条件组合为乙醇体积分数50％，液料比25ml•g－1，提取温度80℃，超声功率700W，在此条件下黄酮得率达到（1．72±0．01）％。与传统试验相比提取效率更加显著，说明超声对凤丹牡丹黄酮提取有较好的促进作用。通过凤丹牡丹果皮中的黄酮提取物的体外抗氧化试验可知，在试验所选取的浓度范围内凤丹牡丹果皮中黄酮提取物对ABTS和DPPH均有清除作用。当黄酮提取物浓度在250μg•ml－1时，对ABTS抗氧化能力达到100％，IC50为13．151μg•ml－1；当浓度在500μg•ml－1时，对DPPH的清除率达到了77．086％，IC50为8．197μg•ml－1。本试验采用超声辅助提取工艺，得到高效、易于操作的凤丹牡丹果皮黄酮提取技术，这为更好地开发和利用凤丹牡丹果皮资源提供了实验依据。

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作者：马晓 陈刚 张洁 单位：河南职业技术学院