大鼠肝脏与蛋白的变化范文

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《航天医学与医学工程杂志》2014年第三期

1方法

1．1实验动物二级雄性SD大鼠100只，体重180～260g(航空医学研究所提供)，适应性饲养7d后随机分为4组，每组25只。其中3组为+Gz暴露组，1组为正常对照组。

1．2试剂与仪器逆转录酶M-MLV(Promega公司);OligoDT，dNTP(10mmol/L)(Takara公司);TRIzol(Invitro-gen公司);大鼠诱导型HSP70cDNA序列(EF100780)、PCR反应体系、HSP70兔抗鼠多克隆抗体、GAPDH鼠抗单克隆抗体(南京金斯瑞);ECL化学发光试剂、HRP标记的山羊抗兔IgG(上海江莱);X光片自动洗片机(柯达X-OMATBT胶片(FF057/FF081));心脏灌注设备;恒温冰冻切片机;Quantimet图像分析系统(德国Leica);动物离心机等。

1．3+Gz暴露3组实验动物分别用离心机进行+Gz暴露。暴露时将大鼠置于一内径为17cm×8cm×5cm的树脂盒中，头部朝向旋转轴心，尾部向外水平并被固定于离心机的平台上，分别暴露于+2Gz，+6Gz，+10Gz，峰值作用时间3min，加速度增长率1G/s。对照组同样条件置于树脂盒中，但不进行+Gz暴露。

1．4样本制备分别于暴露后6h、12h、24h、48h、96h，腹腔注射苯巴比妥钠50mg/kg麻醉大鼠，生理盐水心脏灌注后用4%多聚甲醛灌注2h，迅速取肝脏组织，液氮冷冻，－80℃保存。标本取齐后，包埋肝脏组织，于恒冷切片机中冰冻切片。

1．5RNA提取及RT-PCR检测取冻存裂解的细胞，Trizol法提取细胞RNA，测定RNA浓度和纯度。获得的RNA溶液保存于－80℃待用。利用逆转录酶MMLV进行反转录得到cDNA。利用Premier5．0软件设计引物。HSP70引物上游5’-GGTGCTGACGAAGATAAAGGAC-3’，下游5’-TCGATG-GCCTCGAACAGAG-3’。β-actin引物:上游5’-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游5’-GAGGGACTTCCTGTAACCAC-3’。配制PCR反应体系(25μL):cDNA2μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2×TaqMastermix12．5μL，加ddH2O补齐至25μL。92℃预变性5min，然后92℃30s，54℃30s，72℃30s共32个循环;最后72℃延伸10min。反应结束后取10μL产物，经2%琼脂糖凝胶(含0．5g/mL溴化乙锭)电泳，紫外灯下观察、拍照，计算HSP70与β-actin条带灰度比值。

1．6Westernblot分析收集蛋白样品，电泳，转膜(PVDF膜，Milli-pore公司，美国)，TBST洗膜，然后再以含5%脱脂奶粉的TBST38℃封闭1h。分别加入HSP70兔抗鼠多克隆抗体(1∶800稀释)和GAPDH鼠抗单克隆抗体(1∶4000稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗涤后，GAPDH直接通过ECL化学发光试剂显影;HSP70再加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶10000稀释)，38℃孵育60min，TBST洗涤，ECL化学发光试剂显影。HSP70蛋白相对含量用HSP70/GAPDH灰度比值表示。

1．7统计分析应用SPSS13．0统计软件，利用HSP70/GAPDH灰度比值及HSP70与内对照β-actin条带灰度比值采用重复设计的方差分析进行组内及组间两两比较。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1+Gz暴露大鼠肝脏HSP70mRNA表达+Gz暴露12h各组电泳分析结果见图1，HSP70扩增片段为550bp，β-actin扩增片段为623bp。实验组和对照组HSP70阳性表达率为100%。+Gz暴露后大鼠肝脏HSP70mRNA表达趋势(HSP70/β-actin值)如图2所示。可以看出，暴露后6h，各+Gz暴露组大鼠肝脏组织HSP70mRNA表达水平较对照组相比显著升高(P＜0．05)。暴露后6h、12h、24h、48h4个时间点，各+Gz暴露组大鼠肝脏HSP70mRNA表达水平均高于对照组(P＜0．05);+6Gz组大鼠肝脏HSP70mRNA表达水平均高于+2Gz和+10Gz组(P＜0．05)。+6Gz暴露后12h大鼠肝脏HSP70mRNA表达水平最高(P＜0．05)，+2Gz组HSP70mRNA表达水平在各个时间点明显高于+10Gz组(P＜0．05)，暴露后48h，+2Gz组与+6Gz组HSP70mRNA表达水平无明显差别，但此时+2Gz组与+6Gz组HSP70mRNA表达水平高于+10Gz组(P＜0．05)。暴露后96h，各+Gz组大鼠HSP70mRNA表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P＞0．05)。

2．2+Gz暴露对HSP70蛋白表达的影响以GAPDH为内参照，HSP70蛋白表达量的Westernblot结果见图3，各组不同时间+Gz暴露后HSP70表达趋势(HSP70/GAPDH)如图4所示。可以看出，+Gz暴露后6h、12h、24h、48h4个时间点，3个+Gz暴露组HSP70蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P＜0．05)。+Gz暴露后6h、12h、24h、48h，+6Gz组HSP70表达水平高于+2Gz组、+10Gz组(P0．05)，+2G组表达高于+10Gz组(P＜0．05)。暴露后6h，+2Gz组、+6Gz组HSP70蛋白表达高于+10Gz组(P＜0．05)。暴露后12h，+2Gz组、+6Gz组HSP70蛋白表达高于+10Gz组(P＜0．05)。其中+6Gz暴露后12hHSP70蛋白表达最高，差异有显著性意义(P＜0．05)。+Gz暴露后96h，各+Gz组大鼠肝脏HSP70表达水平与对照组相比，差异无显著性(P＞0．05)。

3讨论

研究表明，在受到加速度、缺血、缺氧、热暴露等因素作用后的生物体通过激活HSF、HSE并与之相结合等步骤，诱导调节转录产生HSP70mR-NA，HSP70mRNA再经转录后经过调节、翻译等步骤表达产生HSP70［8］。本研究结果提示+Gz暴露可刺激肝脏HSP70mRNA及蛋白的表达。本研究中，+Gz暴露诱导产生HSP70mRNA的机制，一方面可能是+Gz暴露导致肝组织相对缺血、缺氧，诱导肝脏组织产生HSP70mRNA。进一步经过转录翻译后生成HSP70，这与既往肝缺血模型诱导HSP70mRNA及HSP70表达的机制是相同的［9-10］。除此之外，+Gz暴露时造成的机体相关脏器的高压力及其在加速度作用下所受到的机械挤压等力学因素，可能在HSP70mRNA的诱导产生中也起着一定的作用，具体机制有待进一步研究。目前，绝大多数学者认为HSP70对缺血、缺氧所致的肝损伤有保护作用。主要有分子伴侣作用、抗炎作用、免疫调节作用、抑制细胞凋亡及抗氧化作用［10-14］。从实验结果来看，+6Gz暴露组诱导产生的HSP70mRNA及HSP70表达水平最高，+2Gz组次之，+10Gz组相对较低。说明在一定G值范围内，随+Gz暴露强度的增加，HSP70mRNA及HSP70的表达水平也相应增高，中等强度G值(+6Gz)作用下，诱导产生的HSP70mRNA及HSP70量最多。但当G值超过一定限度时，随G值水平的增加，HSP70mRNA及蛋白的表达水平反而相对下降。轻度和中度的缺血、缺氧刺激作用时诱导产生的HSP70mRNA及其产物的表达水平较高，表达分布范围也较广，而在重度缺血条件下，肝组织的HSP70mRNA及HSP70的表达反而会受到相对抑制，诱导产生的mRNA及HSP70蛋白的水平相对较低，分布范围也较局限，可能与重度缺血造成脏器组织细胞的严重损伤，使得细胞的转录过程受到抑制有关［3-4］。实验显示，HSP70基因及其产物在正常大鼠肝脏内含量较低，当应激因素(加速度)作用于生物体时，HSP70基因被激活而迅速表达。正加速度暴露后12h，+2Gz组、+6Gz组、+10Gz组所产生的HSP70mRNA及HSP70变化趋势具有一致性，表明其基因无内含子结构，形成的mRNA无需切割修饰，蛋白的组装能够在短时间内完成，HSP70诱导型蛋白可以迅速表达［1］。

4结论

+Gz暴露可以诱导大鼠肝脏组织HSP70mRNA及HSP70蛋白的表达，使大鼠肝脏组织中HSP70mRNA及HSP70蛋白表达水平显著增强。+Gz暴露环境下机体可能通过代偿机制增加HSP70表达实现对肝脏的保护，其具体机制我们将在今后的实验中作进一步的研究。

作者：朱怀成张洪义刘承利张宏义赵刚孔亚林单位：安徽医科大学空军总医院肝胆外科