佐剂性关节炎大鼠骨代谢标志物探讨范文

本站小编为你精心准备了佐剂性关节炎大鼠骨代谢标志物探讨参考范文，愿这些范文能点燃您思维的火花，激发您的写作灵感。欢迎深入阅读并收藏。

《广州中医药大学学报》2015年第六期

类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以慢性破环性关节病变为特征的全身性自身免疫病。其基本病理改变为滑膜炎，表现为滑膜的血管增生和炎症细胞浸润以及滑膜炎导致的滑膜、软骨乃至软骨下骨组织的破坏。临床上，以南蛇藤为主要药物组成的断藤益母汤是治疗RA的有效药物，既往实验研究证实其具有抗炎、调节免疫等作用［2］。佐剂性关节炎（AA）大鼠的病理改变与RA具有相似或相近的临床表现、病理、免疫等特点，是研究RA的较理想模型［3］。血清Ⅰ型胶原羧基末端肽（CTX-Ⅰ）是Ⅰ型胶原蛋白的羧基末端降解产物，是骨重吸收标志物。骨Ⅰ型前胶原氨基端前肽（PⅠNP）反映新合成的Ⅰ型胶原蛋白的变化，是骨形成标志物。这2个指标能较灵敏地反映骨吸收与重建。本研究通过观测单药南蛇藤煎剂、断藤益母汤煎剂、甲氨蝶呤（MTX）对AA病理模型大鼠的关节肿胀度、关节X线评分、血清CTX-Ⅰ、PⅠNP的影响，探讨断藤益母汤对完全弗氏佐剂致敏病理模型大鼠关节骨吸收、重建的作用，为断藤益母汤的组方提供实验依据，现报告如下。

1材料与方法

1．1实验动物SPF级雌性SD大鼠72只，体质量（200±20）g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK粤2013-0092。

1．2药物、试剂与仪器南蛇藤(广州岭南中药饮片有限公司，批号：140301)；益母草(广东省药材公司中药饮片厂，批号：85313711)；续断(康美药业股份有限公司，批号：140107421)；甲氨蝶呤片（上海信谊药厂有限公司，批号：036130706）；完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；CTX-Ⅰ酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒及PⅠNPELISA试剂盒（武汉华美公司）；FA204B型电子精密天平(上海皖衡电子仪器有限公司)；680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；PV-200型足趾容积测量仪(成都泰盟科技有限公司)；EQ.0•5pb/40KY型钼靶机(意大利吉特公司)；LABY01型高速低温离心机(广州天臣实验室有限公司)。

1．3药物的制备与剂量单方和复方的高、中、低剂量组分别给予临床等效剂量换算后的10、5、1倍药量，其中单方为南蛇藤煎剂，复方为断藤益母汤煎剂。单方高、中、低剂量组给药剂量为南蛇藤47、23.5、4.7g•kg-1•d-1，复方高、中、低剂量组给予南蛇藤47、23.5、4.7g•kg-1•d-1+续断16、8、1.6g•kg-1•d-1+益母草31、15.5、3.1g•kg-1•d-1。煎煮方法：南蛇藤先煎3.5h，加入续断和益母草同煎1h，由广州中医药大学第一附属医院煎药室煎至特定用量，装瓶放置于4℃冰箱中保存备用。MTX组给予MTX片1.06mg/kg，每周1次，溶于生理盐水配至所需用量。

1.4分组、造模与给药将72只SD大鼠随机分为9组，即空白组、模型组、MTX组、单方低剂量组（单低组）、单方中剂量组（单中组）、单方高剂量组（单高组）、复方低剂量组（复低组）、复方中剂量组（复中组）和复方高剂量组（复高组），每组均为8只。适应性喂养3d。参照文献［3］方法，除空白组外，其他组大鼠于右足趾皮下注射完全弗氏佐剂0.15mL。造模当天开始灌胃给药。空白组、模型组给予生理盐水10mL•kg-1•d-1，中药组给予对应中药10mL•kg-1•d-1，MTX组给予MTX水溶液每周10mL•kg-1。给药36d。

1.5关节肿胀的观察采用容积法测量并计算关节肿胀度，关节肿胀度（%）=（注射后所测值-注射前所测值）/注射前所测值×100%。

1.6血清CTX-I、PⅠNP水平检测给药36d后腹主动脉采血，采用ELISA法检测血清CTX-Ⅰ、PⅠNP水平。步骤如下：全血标本离心取上清用样本稀释液1∶20倍稀释后待检；配置标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液；分别设标准品孔、待测样本孔加样；按弃液、甩干、洗版步骤，依次加入生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，然后依序每孔先后加入底物溶液、终止溶液；反应终止后5min内采用酶标仪测量各孔的光密度（D）值；最后用标准品浓度与D值计算出标准曲线的回归方程式，将样本的D值代入方程式，计算出样本浓度。

1.7踝关节X线片评价取大鼠右足，采用钼靶X线检测，由影像学医生盲法阅片后评分。评分标准采用美国风湿病学会推荐的放射学评分标准［1］。0分：正常；1分：X线检查无破坏性改变，可见骨质疏松；2分：表现骨质疏松，可有轻度软骨破坏，有或没有轻度的软骨下骨质破坏，可见关节活动受限，但无畸形；3分：骨质疏松加上软骨或骨质破坏，关节畸形，无纤维性或骨性强直；4分：纤维性或骨性强直。

1.8统计方法计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。统计软件用SPSS19.0，统计方法采用单因素方差分析，以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组足肿胀度表1结果显示：模型组大鼠足肿胀度显著增加，与空白组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，给药36d后，各给药组足肿胀度显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），各给药组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2各组踝关节X线片评分表2结果显示：模型组踝关节X线片均出现明显的关节破坏，部分甚至出现纤维性或骨性强直，X线评分与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。各给药组X线评分与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），各给药组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。2.3各组血清CTX-Ⅰ、PⅠNP水平表3结果显示：模型组CTX-Ⅰ水平显著高于空白组（P＜0.05）；MTX组、复方低剂量组可显著降低CTX-Ⅰ水平，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。各组间PⅠNP水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

本研究造模后AA模型组大鼠关节肿胀度、X线评分均较空白组显著升高（P＜0.05），表明造模成功。各给药组AA大鼠关节肿胀度、X线评分显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），中药组与MTX组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），提示南蛇藤单药煎剂，南蛇藤配伍续断、益母草均能有效抗炎、消肿，减轻骨破坏、保护骨质，其有效程度与MTX相仿，与既往研究结果相符。各中药组大鼠关节肿胀度、X线评分组间呈现一定量效趋势，但差异无统计学意义，可能与观测时间短有关。各组间PⅠNP水平比较差异无统计学意义，分析其原因可能与以下因素有关：PⅠNP较稳定地反映骨形成的水平，能长时间存在于血液循环中。因本研究时间短，PⅠNP未能完全反映各组间骨重建差异。国外文献报道临床观测CTX-Ⅰ水平下降，但PⅠNP指标仍维持稳定，可为之佐证。

模型组CTX-Ⅰ水平显著高于空白组（P＜0.05），与文献报道类风湿关节炎患者的血清CTX-Ⅰ水平与关节破坏严重程度正相关的结论一致。血清CTX-Ⅰ水平对治疗反应敏感，MTX组CTX-Ⅰ水平与空白组比较差异无统计学意义，较好地反映MTX的治疗作用。中药组中除复方低剂量组外，其他各中药组CTX-Ⅰ水平与模型组比较差异均无统计学意义。对大鼠足肿胀度和X线评分的观察结果显示各中药组的治疗作用明确，可控制关节炎症和阻止骨破坏，其效果与MTX相仿。但中药组CTX-Ⅰ水平升高未能反映中药组的治疗作用，分析可能与CTX-Ⅰ并不仅仅单纯受局部关节的骨吸收影响，同时还受全身骨代谢影响有关，可能原因如下：骨吸收标志物CTX-Ⅰ是破骨细胞活动及骨吸收时的代谢产物，特别是骨基质降解产物，反映关节局部及全身骨代谢水平。换言之，CTX-Ⅰ水平除能反映关节骨破坏情况外，同时受全身骨代谢影响。南蛇藤系卫矛科雷公藤属植物，在临床上雷公藤类制剂具有卵巢毒性为人熟知，实验证实雷公藤制剂连续灌胃14~15d即可导致大鼠卵巢早衰。本研究大鼠为雌性大鼠，南蛇藤煎剂喂养36d，较以往文献15d左右造成大鼠卵巢早衰模型时间更长。

另外研究证实卵巢切除后雌性大鼠出现骨吸收伴随骨转换增强，类似于人正常绝经时骨丢失状态。临床研究发现，绝经后女性CTX-Ⅰ水平显著高于绝经前女性。由此分析，中药组（除复低组外）CTX-Ⅰ水平升高，可能因为大鼠全身骨吸收增加对于CTX-Ⅰ水平影响远大于关节局部；模型组与空白组因无全身骨吸收的影响，其CTX-Ⅰ水平可以反映局部关节破坏情况。引起大鼠全身骨吸收增加原因，分析与南蛇藤的卵巢毒性造成大鼠骨吸收增加有关。提示进一步的研究中应采用去势大鼠的方法，避免南蛇藤卵巢毒性对于骨代谢标志物的干扰。断藤益母汤复低组CTX-Ⅰ水平与空白组、MTX组相当，低于中药组内其余各组，提示南蛇藤加入川续断、益母草配伍后对于总骨吸收水平有降低作用，但随南蛇藤浓度提高，其作用消失。类风湿关节炎属痹证范畴，南蛇藤具有祛风胜湿、行气活血、消肿解毒功效，与之合拍；肝主筋、肾主骨，肝肾内虚为痹证内因，故加川续断功效补肝肾、强筋骨；针对南蛇藤的卵巢毒性，加益母草活血调经，利水消肿。既往实验研究发现续断有抑制去卵巢大鼠骨吸收、防治骨质疏松作用，益母草总黄酮可升高去卵巢大鼠血清中雌二醇水平、椎骨骨密度、下丘脑和海马雌激素受体α、βmRNA表达。复低组CTX-Ⅰ水平下降可能与川续断抑制骨吸收，益母草提高雌二醇水平、雌激素受体水平有关。本研究虽然未直接测定大鼠性激素、骨密度等指标，但通过CTX-Ⅰ水平可侧面反映南蛇藤配伍川续断、益母草具有一定减毒作用。复中组、复高组的CTX-Ⅰ水平升高，未显示出川续断、益母草抑制总体骨吸收的量效关系，可能与随着南蛇藤浓度提高其对骨吸收影响占主要有关，其机理有待进一步研究。

综上所述，对于佐剂性关节炎大鼠，南蛇藤单药煎剂、断藤益母汤、甲氨蝶呤均有明确的抗炎、抗骨质破坏作用，三者作用比较差异均无统计学意义。南蛇藤对于雌性AA大鼠CTX-Ⅰ的作用是双向的，既因抗骨质破坏作用降低CTX-Ⅰ浓度，也因卵巢毒性导致骨吸收升高CTX-Ⅰ浓度。加入川续断、益母草组成复方后可降低南蛇藤副作用，但随着南蛇藤剂量的提高，其降低南蛇藤副作用的效果消失。

作者：雷旭杰 张明英 郭丽 林昌松 单位：广州中医药大学第一附属医院风湿病科 广州市荔湾区第二人民医院