间充质干细胞保存研究范文

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《国际检验医学杂志》2014年第十二期

1资料与方法

1．1方法

1．1．1分离培养hBMSCs在志愿者髂前上棘抽取骨髓10mL。采集的骨髓用生理盐水1∶1稀释，密度为1．077g／L的淋巴细胞分离液2000r／min离心15min，收集白膜层，生理盐水漂洗2次。以含10％FBS的L－DMEM作为完全培养液，以一定密度接种于75mL培养瓶中，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每2～3d换液1次，待细胞达80％融合时，用0．25％胰酶＋0．02％ED－TA消化，以1∶3的比例传代培养。

1．1．2流式检测hBMSCs表型hBMSCs用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化，1000r／min离心5min，生理盐水洗涤，制备成1×106／mL单细胞悬液，分别加入荧光标记的鼠抗人CD34、CD29、CD105抗体，设置空白对照，避光冰育30min，生理盐水洗涤3次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1．1．3鉴定hBMSCs多向分化潜能以4×103／cm2密度将第3代hBMSCs接种于6孔板，每孔2mL。（1）成脂诱导及鉴定：细胞达到完全融合后4d，实验组加入脂肪诱导液（H－DMEM，10％FCS，0．5mmol／LIBMX，10μg／mL牛胰岛素，0．2mmol／Lindomethacin，1μmol／L地塞米松）诱导3d，再用脂肪保持液（H－DMEM，10μg／mL牛胰岛素，10％FCS）处理1d，循环3次，再用脂肪保持液处理2d。对照组加入含10％FCS的H－DMEM，每3天换液1次。2周后油红O染色鉴定。（2）成骨诱导及鉴定：细胞达到60％～70％融合后，实验组加入成骨细胞诱导液（OS，含1×10－7mol／L地塞米松，10mmol／L甘油磷酸钠，50g／mL维生素C），对照组加入L－DMEM完全培养液，置培养箱中，每2天换液1次，第21天终止诱导。茜素红S染色鉴定。

1．1．4分组处理hBMSCs采用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化hBMSCs，用不同输注液制备单细胞悬液。根据输注液不同分为生理盐水组（9g／L氯化钠注射液）、糖盐组（50g／L葡萄糖氯化钠注射液）、清蛋白组（含5％人血清蛋白的氯化钠注射液）。分别在4℃和25℃温度条件下置于不同时间点（0．5、1．0、2．0、4．0，6．0h）后进行以下检测。（1）取90μL细胞悬液与10μL胎盘蓝混匀，3min内计数活细胞（未染色）和死细胞（染色），测定细胞存活率。（2）另取1×106／mL细胞行流式细胞术检测细胞表型CD34、CD29、CD105。（3）再将不同分组细胞悬液，1000r／min离心5min，采用含10％FBS的L－DMEM作为完全培养液，以1×103／mL密度接种于96孔板，每组设3个复孔，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养7d。采用CCK－8在酶联免疫检测仪上测定450nm各孔波长吸光度（A）值，以时间为横轴，A值为纵轴绘制生长曲线。

1．2统计学处理采用SPSS17．0进行数据分析，结果用x±s表示。采用t检验进行两组均数间比较，采用单因素方差分析进行多组均数间比较，采用LSD最小显著差数法进行均数间两两比较。P＜0．05表示差别有统计学意义。

2结果

2．1hBMSCs形态观察原代hBMSCs贴壁后，呈圆形，散在分布。3d后完全换液，去除未贴壁细胞，可见少量分散短梭形贴壁细胞。第14天时，贴壁细胞融合成单层，细胞排列有明显方向性，呈漩涡状。见图。

2．2hBMSCs的表型流式检测第3代hBMSCs的表型发现，CD105阳性率98．7％，CD29阳性率97．7％，表达率极高；CD34阳性率为2．9％，表达呈阴性。

2．3hBMSCs分化能力鉴定hBMSCs成脂诱导2周后，光学显微镜下可见大量融合成串珠状的圆形脂滴。油红O染色可见被染成橙红色的脂滴，显示分离的hBMSCs可被诱导向脂肪细胞分化。成骨诱导3周，细胞逐渐融合，失去细胞结构，14d左右出现明显钙结节，茜素红S染色后可见散在大量橘红色钙结节，显示培养的hBMSCs可被诱导向成骨细胞分化。

2．4hBMSCs存活率检测在5个时间点（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）对保存在25℃、4℃的3个实验组的细胞存活率检测，结果见表1～2。结果显示，糖盐组细胞存活率最低，25℃保存4．0h时只有约10％细胞存活；而清蛋白组细胞存活率最高，25℃保存2．0h时清蛋白组细胞存活率仍可达90％，差异有统计学意义（P＜0．05）。25℃和4℃条件下，保存0．5h时，生理盐水组及清蛋白组细胞存活率都超过90％，随着保存时间延长，各组细胞存活率逐渐下降。

2．5不同分组细胞表型检测25℃和4℃条件下，在5个时间点（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）对3个实验组的细胞表型检测，结果见表3～5。结果表明，不同输注液、保存温度及保存时间对细胞表型影响差异无统计学意义（P＞0．05）。

2．6细胞生长曲线测定将不同分组处理后的细胞，采用L－DMEM完全培养液重新接种培养，检测细胞增殖能力，结果见图2（见《国际检验医学杂志》网站“论文附件”）。50g／L葡萄糖氯化钠注射液组保存的细胞增殖能力最差，保存4h后细胞失去贴壁和生长能力（无细胞贴壁无法完成生长曲线）。5％人血清清蛋白氯化钠注射液组细胞增殖能力比9g／L氯化钠注射液组细胞增殖能力强。同一组细胞4℃条件下不同时间点的增殖能力比25℃条件下强。随着保存时间延长，各组细胞增殖能力逐渐下降。

3讨论

hBMSCs是来源于骨髓的间质干细胞，不仅能分化成肝细胞、胆管上皮细胞［4］、血管内皮细胞［5］、不同类型的皮肤细胞［6］、神经样［7］细胞，还具有免疫调节、炎症趋化等特性，使其在肝脏疾病、血管外科、烧伤整形外科及神经损伤等疾病治疗中发挥越来越重要的作用。干细胞注射液从实验室制备到运送至病房回输给患者具有一定时空距离，特别是随着异地移植病例的增多，如何有效地保存干细胞注射液，对于细胞移植的临床应用非常重要。目前相关研究更多集中于将干细胞冷冻于－80℃或液氮等进行长期保存的探讨［8－9］，有关短时保存条件对干细胞生存和生长影响的研究不多。本实验探讨了几种临床常用注射液在不同温度下短时保存干细胞对细胞存活和增殖能力等状况的影响。形态学观察显示，培养的细胞呈均一长梭形，辐射状生长；流式细胞术检测细胞表型显示CD34表达阴性，CD29、CD105表达阳性；成脂诱导后出现大量脂滴，成骨诱导后出现钙结节，表明该细胞确为hBMSCs。

通过3种注射液比较结果显示，在同等温度和时间条件下，50g／L葡萄糖氯化钠注射液对细胞活力影响最大，可能与细胞利用葡萄糖产生大量乳酸加重细胞损伤有关；能为细胞提供营养物质的5％人血清清蛋白氯化钠注射液对细胞活力影响最小。考虑到输注液对细胞活力的影响，建议使用含5％人血清清蛋白氯化钠注射液作为输注液，如患者不宜使用，可选择使用9g／L氯化钠注射液，但不宜使用50g／L葡萄糖氯化钠注射液作为输注液。2种温度比较结果显示，4℃保存对细胞增殖能力的影响更小，可能相对低温可以降低细胞代谢速度，延缓其凋亡。用于临床治疗的hBMSCs注射液室温保存最好不要超过1．0h，不能及时回输时需存放在4℃，但也不要超过2．0h。将干细胞保存在上述几种注射液中，随着保存时间延长，其存活率、贴壁及增殖能力均显著下降，可能与注射液营养成分及生长因子等细胞生长所需要的条件缺乏有关。不同输注液、保存温度及保存时间对细胞表型影响差异无统计学意义（P＞0．05），表明不同保存条件不会引起细胞表面物质的脱落，仅引起细胞凋亡。综上所述，临床常用注射液对细胞活力影响较大，hBM－SCs一旦制备成细胞注射液，应尽可能保存在4℃，及时运送至临床回输给患者，这样才能保持细胞活力，满足临床需要。

作者：陈京季明芳李晓玲方慧云余元龙程伟民单位：中山大学附属中山医院肿瘤研究所