苦参生物碱和黄酮体外抑菌活性研究范文

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《广东药学院学报》2016年第5期

摘要:

目的探讨苦参生物碱、黄酮及其单体(苦参碱、氧化苦参碱、苦参酮、槐属二氢黄酮G、5-methyl-KushenolC、三叶豆紫檀苷和高丽槐素)对不同菌株的体外抑菌作用。方法采用96孔板微量稀释法测定药物的最小抑菌浓度(MIC);薄层色谱-直接生物自显影法测定药物的抑菌检测限(LOD);纸片扩散法测定苦参黄酮单体的抑菌圈直径大小。结果苦参总生物碱、总黄酮对金黄色葡萄球菌的MIC值范围分别为4．95～31．64mg/mL和7．50～31．64mg/mL，对大肠埃希菌的MIC值范围分别为1～4mg/mL和1～4mg/mL。苦参生物碱单体对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的LOD值均大于10μg;黄酮单体对金黄色葡萄球菌的LOD值为1．3～2．5μg，对大肠埃希菌的LOD值小于1．3μg。各黄酮单体中，槐属二氢黄酮G抑菌作用最强，其次是苦参酮和高丽槐素，三叶豆紫檀苷无抑制作用。结论对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，苦参总黄酮及单体的抑菌效果均优于苦参总生物碱及其单体。

关键词:

苦参;生物碱;黄酮;微量稀释法;薄层色谱-直接生物自显影;纸片扩散法;抑菌作用

苦参为豆科槐属植物，是我国历史悠久的传统药物之一，具有清热燥湿、杀虫、利尿的功效，临床常用于湿疹、皮肤瘙痒、滴虫性阴道炎等［1］，疗效显著。生物碱成分一直被认为是苦参的主要有效成分，但并非苦参专属性成分，山豆根、苦豆子等同科中药具有与苦参非常相似的生物碱，却具有明显不同的临床应用［2-4］，这提示仅用生物碱成分来评价苦参的质量和药效是有局限性的，苦参中除生物碱外可能另有起关键作用的有效成分。近年来，大量研究表明苦参中含有丰富的黄酮类成分，具有抗菌、抗感染、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多方面的生物活性［5］。有关苦参生物碱和黄酮抑菌作用的已有很多研究报道［6-9］，但两者抑菌活性孰强孰弱，目前仅有杜思邈等［10］对此进行了研究。本文采用微量稀释法、薄层色谱-直接生物自显影法和纸片扩散法比较苦参生物碱和黄酮对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、伤寒杆菌、大肠埃希菌、痢疾志贺氏菌和铜绿假单胞菌的抑制作用，为苦参新型抑菌制剂的合理开发提供理论依据。

1材料与试药

1．1仪器与设备

FA(N)/IA(N)电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);AY120万分之一天平(日本岛津公司);KQ-2200B超声波清洗器(巩义市予华有限公司);WZT-1M细菌浊度仪(麦氏单位，上海劲佳科学仪器有限公司);电热恒温培养箱HPX-9162MBE(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);SW-CJ-1F型单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司);GF254薄层板(青岛海洋化工厂分厂);96孔板(Costar公司)。

1．2药物与试剂

15个产地的苦参药材由广东药学院生药研究室马鸿雁副教授提供和鉴定，经鉴定均为豆科植物苦参的干燥根(表1);苦参碱对照品(批号PS15040201)和氧化苦参碱对照品(批号PS14042001)均购自成都普思生物科技股份有限公司，纯度≥98%;苦参酮、槐属二氢黄酮G、三叶豆紫檀苷、高丽槐素和5-methyl-KushenolC均为自制对照品，经HPLC峰面积归一化法计算，纯度均大于98%;普通营养肉汤、营养琼脂(BS1002;BS1003;杭州百思生物技术有限公司);2，3，5-氯化三苯基四氮唑显色剂(TTC，Amresco公司);3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐显色剂(MTT，Aladdin公司);其他试剂均为分析纯。

1．3菌株

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、伤寒杆菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌均购于广东省微生物菌种保藏中心，经广东药科大学基础学院微生物教研室进行传代培养，并由马艳高级实验师鉴定确认后惠赠。将上述菌种接种于营养琼脂中，置37℃恒温培养箱培养24h，4℃保存备用。

2方法

2．1培养基制备

普通营养肉汤、营养琼脂均按说明书方法配制，121℃高压灭菌30min，备用。

2．2显色剂

TTC显色剂:用蒸馏水配制成2．5mg/mlTTC溶液，避光保存，备用。MTT显色剂:用PBS缓冲液配制成质量浓度为5mg/mL的MTT-PBS溶液。

2．3苦参总生物碱提取物的制备

取15个产地苦参饮片10．0g，加蒸馏水100mL，煎煮30min，趁热滤过，残渣加100mL蒸馏水同法煎煮1次，滤过;合并滤液，浓缩至含生药500mg/mL，4℃保存备用。

2．4苦参总黄酮提取物的制备

参照文献［11］方法制备得到15个产地苦参总黄酮提取液，滤液蒸干，取适量浸膏配成质量浓度为32mg/mL的储备液。实验时取适量储备液过0．45μm微孔滤膜，用蒸馏水配成质量浓度为8mg/mL的初始浓度药液。

2．5溶液的制备

取苦参碱、氧化苦参碱、苦参酮、槐属二氢黄酮G和5-methyl-KushenolC对照品，分别加甲醇配成初质量浓度为2mg/mL对照品溶液，然后倍比稀释成1、0．5、0．25、0．125、0．0625mg/mL甲醇溶液，备用。取三叶豆紫檀苷、槐属二氢黄酮G、苦参酮、高丽槐素，分别精密称定1．0mg，用蒸馏水配成质量浓度为0．1mg/mL的药物原液，备用。配制质量浓度为2．5mg/mL的氨苄西林药液作为阳性对照，备用。

2．6菌悬液制备

受试菌种用液体培养基配成菌悬液后，再用细菌浊度仪配制成浓度为5×108CFU/mL的菌液，备用。

2．7微量稀释法测MIC值

参照文献［12］采用微量稀释法测定样品对不同菌株的MIC值，96孔板置37℃培养箱中培养18～24h，培养结束前3h每孔加入2．5mg/mLTTC溶液10μL，继续培养1～3h后观察生长情况，有细菌生长孔呈红色，以肉眼观察不到菌落生长的最低药物浓度为该药物对该种细菌的MIC。

2．8薄层色谱-直接生物自显影评价抑菌能力

参照文献［13］采用直接生物自显影方法评价苦参单体化合物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。处理过的薄层板在37℃下培养10h;培养结束后将5mg/mLMTT-PBS溶液均匀喷洒到薄层板上，37℃下培养4～5h后观察显色结果，有抑菌活性的斑点将在显色背景下表现出明显的抑菌圈。

2．9纸片扩散法测定抑菌圈直径

取菌悬液0．2mL涂布于琼脂培养基上，将灭菌的滤纸片(直径d0=7mm)浸泡于药液中片刻，取出，略干后贴于平板表面，2%吐温80滤纸片为阴性对照，37℃培养24h，测定抑菌圈直径(d)。

3结果

3．115个产地苦参的最小抑菌浓度

苦参总生物碱和总黄酮的MIC结果见图1。由结果可知，不同产地苦参均有一定的抑菌作用，苦参总生物碱对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的MIC值范围分别为4．95～31．64mg/mL和7．50～31．64mg/mL;苦参总黄酮对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的MIC值的范围均为1～4mg/mL。通过比较苦参总生物碱和总黄酮的MIC，15个产地中湖南邵阳(6)所产苦参的抑菌效果最好，其次是河南南阳(1)和云南曲靖(7)。

3．2苦参生物碱和黄酮单体的抑菌检测限

苦参碱、氧化苦参碱、槐属二氢黄酮G、苦参酮和5-methyl-KushenolC抑菌作用的结果见图2。苦参碱、氧化苦参碱对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的LOD值均大于10μg;槐属二氢黄酮G、苦参酮和5-methyl-KushenolC对金黄色葡萄球菌的LOD值为1．3～2．5μg，对大肠埃希菌的LOD值均小于1．3μg。结果表明，相同浓度下，无论是金黄色葡萄球菌还是大肠埃希菌，黄酮单体的抑菌效果都明显优于生物碱单体。

3．3苦参黄酮单体的抑菌圈直径

5个苦参黄酮单体抑菌作用的结果见表2。可见，槐属二氢黄酮G、苦参酮和高丽槐素对细菌均有抑制作用;槐属二氢黄酮G抑菌作用最强，对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌)和革兰阴性菌(大肠埃希菌、伤寒杆菌和痢疾志贺菌)均有一定抑制作用;苦参酮和高丽槐素抑菌作用相当，都只对革兰阳性菌有抑制作用，对革兰阴性菌无抑制作用;三叶豆紫檀苷作用最弱，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均无抑制作用;氨苄西林和苦参各成分对革兰阴性菌铜绿假单胞菌均无抑制作用。

4讨论

苦参主要成分是以苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱等为主的生物碱类化合物和以苦参酮、槐属二氢黄酮G、三叶豆紫檀苷、KushenolI等为主的黄酮类化合物。生物碱提取常用三氯甲烷、三氯甲烷+浓氨水、水等作为提取溶剂，由于三氯甲烷有毒，而三氯甲烷+浓氨水溶液提取法操作繁琐、耗时，目前生物碱提取主要是用水煎煮或回流提取［14-15］;黄酮提取常用甲醇、乙醇、乙酸乙酯等超声提取，其中以乙酸乙酯超声提取法对苦参黄酮类成分提取效率最高，杂质斑点较少，故本文选用该法提取苦参总黄酮［11，16］。本文采用微量稀释法、薄层色谱-直接生物自显影法和纸片扩散法同时比较苦参总生物碱和总黄酮对不同细菌的抑制作用，结果显示苦参黄酮化合物的抑菌效果明显强于生物碱，与杜思邈等［10］报道的结果一致。中药及其有效部位的抑菌机制较为复杂且不完善，主要是通过改变药物的亲脂性，改变菌体细胞膜和离子通道的渗透性，抑制或干预菌体生物功能的合成、转化过程等来改变抑菌活性［17］。革兰阳性菌和革兰阴性菌结构、成分、性质和功能的差异［18］，以及生物碱和黄酮结构的差异都会影响抑菌的效果。就构效关系而言，生物碱的抑菌活性与其氮原子的存在方式和结构修饰有关［19］，黄酮的抑菌活性主要与A、B、C环上的羟基化和A、C环上的O、S、N取代有关，其中大多数异戊烯黄酮自身结构的特异性(容易羟基化和异戊烯基化)能增强其抑菌或杀菌活性［20-22］。Kohanski等［23］发现，杀菌性抗菌药能刺激革兰氏菌生成高度有害的羟基自由基，增加杀菌性抗菌药的杀菌效果，导致细胞死亡，而抑菌性抗菌药并不产生羟基自由基。这提示药物的抑菌效果可能与其羟基自由基的合成和药物浓度也有关系，为更好地筛选杀菌性抗菌药和抑菌性抗菌药，以及研究药物的杀菌活性和抑菌活性提供了科学依据。生物碱和黄酮都是广泛存在于植物中较为复杂的化合物，也是药用植物中的主要活性成分，均具有广谱的药理活性和较低毒性。本文结果表明，苦参总黄酮及其单体均是有潜力的抗菌药物，提示研究苦参制剂抑菌作用时，可同时考虑其生物碱和黄酮作为有效部位。生物碱和黄酮对苦参的贡献是单独作用、协同作用，还是拮抗作用，还有待在今后继续研究。

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作者:黄琦 屈玟珊 高世军 马俊琳 刘龙元 徐麟 马鸿雁 单位:广州中药学院 广东中山医药化工学院 广州中医药大学