电针疗法对大鼠胃肠激素的影响范文

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《北京中医药大学学报》2015年第十二期

摘要:

目的观察电针对糖尿病胃轻瘫(DGP)模型大鼠胃肠激素的影响，探讨电针治疗DGP可能的作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为5组:空白对照组，DGP模型组，电针穴位组，电针非穴组，胃复安对照组，每组12只。采用腹腔一次性注射2%链脲佐菌素(STZ)配合高糖高脂饲料不规则饮食制备DGP大鼠模型，连续8周;用OneTouch血糖仪测血糖，尿糖试纸测尿糖，实验结束后观测大鼠胃排空率、肠移行率，ELISA法检测大鼠血清生长激素(GH)水平和胃窦组织促生长素(Ghrelin)含量。结果与空白对照组比较，DGP模型组大鼠血糖及尿糖值均明显升高(P＜0．01)，胃排空率、肠移行率、血清GH水平及胃窦Ghrelin含量均明显下降(P＜0．01或P＜0．05);与DGP模型组比较，电针穴位组大鼠血糖及尿糖值均明显降低(P＜0．05)，胃排空率、肠移行率、血清GH水平及胃窦Ghrelin含量均明显升高(P＜0．01或P＜0．05)。结论电针能调节血糖水平，促进胃肠排空，改善DGP症状，其作用机制可能与电针上调血清GH水平和胃窦组织Ghrelin含量有关。

关键词:

糖尿病胃轻瘫;电针疗法;促生长素;生长激素;胃排空;大鼠

糖尿病胃轻瘫(DiabeticGastroparesis，DGP)是以胃排空延迟，胃动力低下为主要特点的临床症候群，主要表现为厌食、嗳气、早饱、食欲不振、恶心干呕、体重减轻等症状，是糖尿病的主要慢性并发症之一。其病因复杂多变，大多数研究认为其发病机制可能与高血糖、自主神经病变、胃肠激素失衡及胃肠道平滑肌超微结构的改变等因素有关［1］。胃肠激素的参与则被认为在此类疾病发生发展中发挥了重要作用。研究发现，目前临床治疗DGP常用促胃动力药来缓解症状，但疗效不佳，且长期使用易产生耐药性。而采用针灸治疗DGP有一定的疗效和优势，能治愈或改善胃轻瘫的症状，同时又能兼顾降血糖，起到双重的治疗作用［2－5］。但有关针灸治疗DGP的文献报道大多数只停留在临床研究，基础研究太少，且缺乏作用机制的研究。本实验通过建立DGP大鼠模型，采用ELISA法检测血清生长激素(GH)水平和胃窦组织促生长素(Ghrelin)含量，以探讨电针防治DGP的作用机制。

1材料

1．1动物健康成年SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体重(231±10)g，共60只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号:43004700002152。饲养温度25℃，相对湿度50%～70%，自由摄食、饮水。

1．2主要试剂链脲佐菌素(STZ):美国Sigama公司生产，临用前用0．1mmol/L(pH4．2，4℃)柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液配成2%浓度的溶液;高糖高脂饲料:由普通饲料按比例(普通饲料、熟猪油、蔗糖、奶粉、鸡蛋之比为58∶15∶20∶5∶2)加工而成;血糖试纸:美国强生公司生产;尿糖试纸:广州花都高尔宝生物技术有限公司生产;胃复安:山西云鹏制药生产;酚红:天津恒兴化学试剂制造有限公司生产;柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠:湖南汇虹试剂公司生产;三氯乙酸:天津科密欧化学试剂有限公司生产;大鼠GH、Ghrelin酶联免疫试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1．3主要仪器血糖仪:美国强生公司生产;电子天平:日本岛津AEL-120型;电针仪:华佗牌SDZ-Ⅱ型;针灸针:苏州华伦医疗用品有限公司生产;紫外分光光度计:日本岛津UV-1800型;酶标仪:上海热电MultiskanMK3。

2方法

2．1糖尿病胃轻瘫模型制作根据参考文献［6］，将大鼠购回先适应性喂养7d，均经血糖试纸检测、尿糖试纸检测，血糖正常、尿糖阴性者入选。禁食12h，空白对照组大鼠于左下腹腔内单次注射等容量的0．1mmol/L(pH4．2，4℃)柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液，剩余大鼠按55mg/kg的剂量于左下腹腔内单次注射2%STZ溶液，72h后取尾静脉血用OneTouch血糖仪和血糖试纸测血糖，即刻血糖≥16．7mmol/L者作为糖尿病大鼠。空白对照组大鼠给予普通饲料规则喂养，剩余大鼠给予高糖高脂饲料不规则喂养(即采取单日上午和双日下午进食法)，每周测定血糖及尿糖1次，同时观察大鼠的体重、饮食、饮水、毛色、大小便、活动及精神状况等，持续8周，期间检测血糖＜16．7mmol/L者予以剔除实验。DGP造模成功指标:①监测大鼠血糖、尿糖，血糖≥16．7mmol/L、尿糖阳性者;②大鼠一般情况及大便性状与正常对照组有明显差别者;③大鼠胃排空率及肠移行率与正常对照组相比有显著差异者。模型制作方法详见参考文献［7］。

2．2穴位及非穴对照点定位穴位定位参照李忠仁主编的《实验针灸学》常用动物穴位定位法及拟人对照法定位。“足三里”:膝关节后外侧，腓骨小头下约5mm处;“三阴交”:后肢内踝尖直上10mm处;“梁门”:以胸骨柄上缘和耻骨联合连线下1/4与上3/4交点为肚脐，胸剑联合到肚脐连线中点的水平线与锁骨中线相交处;“足三里”对照点:在平“足三里”穴外侧5mm处;“三阴交”对照点:在平“三阴交”穴后侧5mm处;“梁门”对照点:在平“梁门”穴外侧5mm处。

2．3电针方法将大鼠束缚于鼠板上，取大鼠单侧“足三里”“三阴交”“梁门”穴或这些穴位的对照点(非穴点)，定位后局部剪毛，穴位针刺由专人操作，均采用0．25mm×25mm毫针直刺5～7mm，针刺后，用电针仪的一组输出线的负极接在穴位或非穴位对照点上，正极接在该穴位或非穴对照点下2mm的附点上，每只大鼠共接3组输出线，用疏密波(疏波为10Hz，密波为50Hz;疏波时间为10s，密波时间为15s)，强度以毫针或穴位周围肌肉出现轻微颤抖为度，留针20min，隔日左右交替治疗，每日1次，连续治疗15d。

2．4分组治疗将60只SD大鼠完全随机分成5组:空白对照组，DGP模型组，电针穴位组(模型+电针穴位组)，电针非穴位组(模型+电针穴位对照点组)，胃复安对照组(模型+胃复安灌胃组)，每组12只。空白对照组、DGP模型组大鼠每日仅捆绑不针刺20min，电针穴位组每日捆绑后电针穴位20min，电针非穴组每日捆绑后电针穴位对照点20min，胃复安对照组每日予以1．7%胃复安药液(0．17mg/kg)灌胃治疗，每日1次，连续处理15d，实验期间大鼠均自由摄食和饮水。实验结束后，大鼠禁食24h，禁水2h，于第16天给予5g/L酚红溶液2mL灌胃，20min后以10%水合氯醛按3mL/kg剂量腹腔注射麻醉后取材。

2．5标本采集血清处理:大鼠麻醉固定后，予腹主动脉采血，常温放置2～3h，4℃3000r/min离心15min，取上清液，EP管分装，－20℃保存，待测GH水平。胃肠处理:大鼠剖腹，结扎贲门及幽门取胃，沿胃大弯切开，用冰0．9%氯化钠溶液冲洗并收集胃内容物，定容20mL，测胃排空;迅速剪取胃窦组织一块置冻存管中，液氮中保存，待测Ghrelin含量;取小肠，测肠移行率。

2．6指标检测(1)一般情况:仔细观察大鼠的血糖、尿糖、体重、饮食、饮水、毛色、大小便、活动及精神状况。(2)胃排空:将收集的20mL胃内容物加入0．5mol/LNaOH20mL搅拌混匀，静置1h后取5mL上清液，加入20%三氯乙酸0．5mL去蛋白，以3500r/min离心10min，取上清液在560nm波长紫外分光光度计下检测吸光度值(OD)。胃排空率计算:胃排空率=［1－实测酚红吸光度(OD)/标准酚红吸光度(OD)］×100%。(3)肠移行率:将小肠轻轻剥离后直铺在冰面上，不牵扯，先肉眼观察小肠被酚红染成红色的末端，然后用眼科剪在该末端剪一小口，往该口上滴少量0．5mol/L的NaOH溶液，若变紫色则为酚红到达的部位，之后在紫色区前后各滴少量NaOH溶液以确定酚红到达的实际部位，然后用直尺测量幽门至回盲瓣全长(A)及幽门至酚红染成红色末端的距离(a)。以幽门至酚红染成红色末端的距离占幽门至回盲瓣全长的百分率为肠移行率。肠移行率(%)=a/A×100%。(4)胃肠激素测定:按照南京建成生物工程研究所试剂盒的要求，采用ELISA法检测血清GH水平及胃窦组织Ghrelin含量。

2．7统计方法所有数据使用SPSS17．0统计软件进行处理。资料进行正态性检验，符合正态分布的数据用均数±标准差(x珋±s)表示，多组计量资料采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，方差齐者用LSD法，方差不齐者用Dunnett’sT3法;不符合正态分布的数据用中位数(M)、四分位间距(Q)表示，采用秩和检验。以α=0．05作为检验水准。

3结果

3．1一般情况实验期间，空白对照组大鼠表现机警活泼、反应灵敏、毛色光滑，进食及二便均正常;模型组和治疗组大鼠在造模3d后均出现多饮、多食、多尿，粪便稀溏，味重，4周后，大鼠出现食欲不振、精神萎靡、反应迟缓，逐渐出现尿少，大便干稀不定，味臭难闻，体重与空白对照组比较明显减轻，尤其以模型组最为明显。

3．2治疗后各组大鼠血糖、尿糖值比较与空白对照组比较，DGP模型组大鼠血糖及尿糖值均显著升高，差异有统计学意义(P＜0．01)，说明造模后，各组大鼠血糖及尿糖值均持续升高;与DGP模型组比较，电针穴位组大鼠血糖及尿糖值均降低，差异有统计学意义(P＜0．05);与胃复安对照组比较，电针穴位组大鼠血糖及尿糖值均降低，差异有统计学意义(P＜0．05)。说明电针穴位可降低血糖及尿糖值，调节大鼠的血糖水平，改善DGP症状。结果见表1。

3．3各组大鼠胃排空率和肠移行率比较与空白对照组比较，DGP模型组大鼠胃排空率和肠移行率均明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明造模组大鼠胃排空时间延长，小肠移行缓慢;与DGP模型组比较，电针穴位组大鼠胃排空率和肠移行率均明显升高，差异有统计学意义(P＜0．01)。与电针非穴组比较，电针穴位组胃排空率和肠移行率均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明电针治疗后，电针穴位组能明显改善胃排空状况，增加胃肠运动功能。结果见表2。

3．4各组大鼠血清GH水平、胃窦组织Ghrelin含量的比较与空白对照组比较，DGP模型组大鼠GH水平和Ghrelin含量明显下降，差异具有统计学意义(P＜0．05或P＜0．01);与DGP模型组比较，电针穴位组大鼠GH水平和Ghrelin含量明显升高(P＜0．05或P＜0．01)。结果见表3。

4讨论

糖尿病胃轻瘫是糖尿病最主要的慢性并发症之一，多见于血糖控制不佳的糖尿病患者，严重影响患者的工作和生活质量［8］。其主要特点是胃排空延迟，胃节律紊乱，胃动力低下，从而导致胃麻痹，近年来的基础研究发现，胃肠激素在胃运动的调节中发挥了重要作用。Ghrelin是1999年Kojima等发现的第一个生长激素促分泌素受体的内源性配体，由28个氨基酸组成的小分子多肽。Ghrelin除在摄食和能量代谢、心血管功能等方面具有调节作用外，还具有调节胃肠动力作用。邱氏等［9］证实了Ghrelin能提高糖尿病小鼠的胃排空能力，其作用机制可能是通过肌间神经丛神经系统的硝基能神经和胆碱能神经上的受体而起作用。GH由胃底部黏膜泌酸腺X/A细胞合成并入血，其在调节糖尿病患者血糖浓度及胃动力障碍方面起了重要作用。刘氏等［10］研究发现2型糖尿病患者血糖控制不佳可能与皮质醇(PTC)、GH有关。薛氏［11］研究显示糖尿病患者的GH水平较健康人高，胃动力障碍的糖尿病患者GH水平尤其高，通过降低糖尿病患者血清GH可减轻其并发症的发生发展［12］。而本实验结果显示，模型组大鼠GH水平和Ghrelin含量均下降，胃排空率和肠移行率明显减慢，血糖及尿糖值升高，与正常对照组比较P＜0．05或P＜0．01，与文献报道不相一致。有研究发现，Ghrelin具有促进垂体前叶分泌GH［13］，模型组大鼠血清GH水平降低可能是由于Ghrelin含量降低抑制垂体前叶分泌GH。经过治疗后，电针穴位组大鼠血清GH水平、胃窦Ghrelin含量、胃排空率及肠移行率均明显升高，血糖及尿糖值均明显下降，可能是由于Ghrelin含量升高作用于垂体前叶分泌GH。本实验结果表明，电针能调节大鼠血糖水平，促进胃肠排空，改善胃肠运动功能障碍，其作用机制可能是电针治疗能上调血清GH水平和胃窦组织Gh-relin含量，但具体通过何种通路产生作用，则有待进一步研究。

参考文献:

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［13］WARZECHAZ，DEMBINSKIiA．Protectiveandthera-peuticeffectsofghrelininthegut［J］．CurrMedChem，2012，19(1):118－125．

作者：林亚平 贺凤娥 彭艳 万全荃 沈菁 单位：湖南中医药大学针灸推拿学院 针灸生物信息分析重点实验室 湖南中医药大学研究生院