人肾近曲小管上皮细胞凋亡及调控范文

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《安徽医科大学学报》2016年第四期

摘要

目的研究高糖诱导人肾近曲小管上皮细胞凋亡及其调控机制。方法以人肾近曲小管上皮细胞株HK2为研究对象，随机分为对照组、高糖组、甘露醇组。MTT、流式细胞术观察细胞的增殖和凋亡状况；ELISA法检测细胞内Caspase的活性；Westernblot法分析B淋巴细胞瘤2（Bcl2）及Caspase家族蛋白的表达变化。结果与对照组比较，高糖组能抑制HK2细胞的体外增殖，下调抑制凋亡作用的蛋白Bcl2表达，上调促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表达（P＜005）；流式细胞术显示HK2细胞周期有明显的变化，且随葡萄糖浓度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明显上升（P＜001），并且Caspase酶原降解及活性表达也呈上升趋势（P＜001）。结论高糖能抑制HK2细胞体外增殖并诱导其凋亡，其机制可能是通过Bcl2及Caspase家族调控HK2细胞的凋亡。

关键词

高糖；HK2；凋亡；表达

细胞凋亡是生理性过程，不同于细胞坏死；凋亡细胞能产生吞噬和清除碎片的凋亡小体，避免周围环境中细胞损害，维持内环境稳定［1］。糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）发病机制复杂，DN早期，肾脏通过细胞凋亡等应急反应来清除过度增殖的内皮细胞，维持内环境稳定；DN晚期，随着肾功能障碍，内环境稳态破坏，细胞凋亡过度，致使肾损害也加剧［2－3］。了解和干预肾小管内皮细胞凋亡有助于延缓DN进展。该研究采用体外培养人肾近曲小管上皮细胞株HK2细胞，分析高糖坏境下HK2细胞的增殖和凋亡状况、B淋巴细胞瘤2（Bcelllymphoma2，Bcl2）及Caspase家族蛋白表达的变化，并进一步探讨这些作用可能的分子调控机制。

1材料与方法

1．1材料低糖（55mmol／L）DMEM（美国Gibico公司）；Dglucose、医用甘露醇（北京国药集团公司）；Gibco原装小牛血清（北京索莱宝科技有限公司）；HK2由中国科学技术大学生命科学院赠送，液氮保存；AnnexinVFITC（安徽碧云天生物试剂公司）；一抗actin、Caspase3、Caspase9、Bcl2、Bax、Bak、Caspase7（美国SantaCruz公司）；MTT（美国Sigma公司）；二抗（美国Pierce公司）。

1．2方法

1．2．1细胞培养和分组液氮取出HK2细胞，37℃水浴解冻，迅速接种于含10％小牛血清低糖DMEM（葡萄糖浓度55mmol／L），37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中。胰酶消化传代，备用。分组：对照组（葡萄糖浓度为55mmol／L）、高糖组（葡萄糖浓度分别为25、40mmol／L）和甘露醇组（葡萄糖浓度55mmol／L＋甘露醇浓度分别为195、345mmol／L）。

1．2．2MTT法检测细胞增殖取生长旺盛的HK2细胞，胰酶消化，按121分组，MTT实验严格按照前期报道［4］操作，实验重复3次。

1．2．3AnnexinVFITC分析细胞凋亡取对数期生长的HK2细胞，胰酶消化传代，制成细胞悬液，取合适的量平均接种于6孔板，次日按121分组，37℃刺激48h，各组胰酶消化制成约1×106个／ml细胞悬液。400μlAnnexinV结合液重悬，加入5μlAnnexinVFITC染色液，2～8℃避光孵育15min。4℃冷冻离心5min（10000r／min），去除上清液，再用400μlAnnexinV结合液重悬，10μl／孔PI染色液，震动器轻轻混匀；锡箔纸包裹置冰上孵育5min，然后上机检测。

1．2．4Caspase蛋白酶原活性检测原理：依据ELISA抗原抗体结合的原理，细胞内活性的Caspase7、Caspase3、Caspase9能在体外与相应的酶结合，催化底物显色反应，通过吸光度（opticaldensity，OD）值OD405来间接反应Caspase7、Caspase3、Caspase9的活性。取对数期生长的HK2细胞，按123步骤操作，分组后置于培养箱连续刺激2d，胰酶消化，冷冻离心5min（10000r／min），按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶标仪检测，实验重复3次。

1．2．5Westernblot法检测提取总蛋白：按121分组批量培养，刺激48h后，弃去原液并用PBS洗去残留液体，置冰上，每瓶加裂解液150μl充分裂解，细胞刮子收集细胞，低温冷冻离心5min（10000r／min），上清液置于－80℃备用，BCA测定蛋白浓度，每组加入浓缩蛋白上样缓冲液，水浴煮沸，分装备用，置于－20℃保存。配制125％SDSPAGE，微量加样针上样，先用40～50V电泳浓缩胶，100V电泳分离胶，100mA冰浴转膜，伊利脱脂牛奶封闭，PBS洗膜，置于一抗为Bcl2（1∶400），Caspase7（1∶1000），Bak（1∶1000），Bax（1∶300），Caspase3（1∶2000），Caspase9（1∶800），actin（1∶1000），4℃过夜。相应二抗分别为山羊抗小鼠（1∶1500），山羊抗鼠（1∶1500），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗小鼠（1∶4000），37℃孵育2h，PBS洗膜3次，暗室内胶片显影、定影，重复实验3次。结果进行统计学分析。Westernblot条带的灰度值用ImagePro45分析软件测定。

1．3统计学处理采用SPSS190软件进行统计学单因素方差分析，数据用珋x±s表示。组间计量资料用方差分析。

2结果

2．1高糖对HK2细胞的体外增殖的影响MTT结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，显示差异有统计学意义（F＝11204，P＜001）。组间两两比较显示，与对照组比较，高糖组（25、40mmol／L）的OD值依次降低，且糖浓度为40mmol／L抑制率达266％（P＜005，P＜001）；而甘露醇组与对照组比较，差异无统计学意义，表明体外高糖能抑制HK2细胞的体外增殖，与高晶体渗透压无关。见表1。

2．2高糖对HK2细胞凋亡的影响结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，差异有统计学意义（F＝8254，P＜001）。组间两两比较显示：与对照组（99％）比较，高糖组（图1B、1C）中期凋亡与末期凋亡所占的比例明显升高，并且末期凋亡所占的比例随着葡萄糖浓度的升高而升高；从图1D、1E中可以观察到甘露醇对细胞的凋亡影响不明显。提示高糖能诱导HK2细胞凋亡，与高晶体渗透压无关。见图1、表2。

2．3高糖对Caspase蛋白酶原活性的影响单因素方差分析显示高糖能够增强Caspase7、Caspase3、Caspase9活性（F＝7143、5581、7432，P＜001）。组间两两比较显示：与对照组比较，高糖组Caspase7、Caspase3、Caspase9活性呈上升趋势，但甘露醇组活性没有明显变化。见图2。

2．4高糖对Bcl2及Caspase蛋白酶原家族蛋白表达的影响单因素方差分析显示高糖上调Bak、bax、cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表达（F＝2741、4754、3722、41772547，P＜001）；下调Bcl2蛋白表达（F＝3314）。组间两两比较显示：与对照组比较，Bcl2家族Bcl2蛋白表达量有所下降，Bak、Bax蛋白表达量显著上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趋势。另外剪切后的Caspase蛋白酶原家族cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表达明显增加，见图3。

3讨论

DN是糖尿病重要并发症之一，其基本病理特征主要表现为肾小球细胞外基质聚集与降解紊乱，导致肾小球病态增生、基底膜增厚和动脉硬化等，这些改变严重影响肾小管的营养供应，诱发上皮细胞程序性凋亡，从而导致肾间质纤维化［5］。国外相关报道［6］证实终末期肾病肾小球损伤多数从肾小球上皮细胞（足细胞）损伤开始；在糖尿病的早期，长期处于高糖环境下的细胞微环境发生改变，导致肾小球超过滤、诱发氧化应激、糖化终产物堆积、蛋白激酶C的激活、多元醇化、转化生长因子的过表达和炎症等，这些因素致使肾小管基底膜增厚，养分供应受阻，引起肾小管上皮细胞萎缩，导致肾衰竭。因此干预肾小管上皮细胞凋亡，维持上皮细胞活性，能有效的减缓肾脏的衰竭［5］。体内长期高血糖容易导致上皮、内皮细胞损伤和功能障碍，从而诱发多种疾病，如2型糖尿病等；因此，控制血糖，并通过调节细胞增殖和凋亡修复损伤的细胞有重要的临床意义［7－8］。本研究模拟体内高糖环境，选取稳定性较好的人肾近曲小管上皮细胞株HK2进行体外培养。作为维持近曲小管功能的上皮细胞，HK2细胞的功能障碍在DN的发生发展中扮演着重要角色。实验表明高糖刺激48h后HK2细胞的增殖抑制，且出现细胞凋亡现象。

Bcl2家族和Caspase共同参与调控细胞凋亡［9－10］。Bcl2家族通过调控Bcl2与Bax、Bak之间的比例，改变线粒体膜的通透性释放细胞色素C等促凋亡蛋白［11－12］，诱导细胞凋亡。而Caspase家族分工协作，Caspase9感受线粒体发出的死亡信号；Caspase3属于凋亡效应子，能直接引起细胞凋亡；Caspase7能促使ROS表达，诱导内质网应激，参与细胞凋亡［13－15］。本实验Westernblot结果表明HK2细胞内Bcl2家族和Caspase家族均被激活，表现为Bcl2蛋白表达量下降，Bak、Bax蛋白表达量上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趋势。另外Caspase蛋白酶原家族Caspase9、Caspase3、Caspase7酶原降解及活性表达也呈上升趋势。推测高糖可能是通过某种途径激活Bcl2家族，释放细胞色素C，引起Caspase酶原降解，活化Caspase家族启动级连反应，诱导HK2细胞发生凋亡。详细机制有待进一步研究。

作者：袁育臖 段惠芳 胡志坚 汪渊 单位：九江学院附属医院 检验科 安徽省／省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室