豚鼠封闭群的遗传学研究范文

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1方法

1.1基因组DNA的提取:采取心脏采血，每只豚鼠采500μL血样，并立即注入4mLEDTA抗凝真空采血管中，充分摇匀并编号。参照《分子克隆指南》及LoparevVN等方案，NaI法提取抗凝血基因组DNA。

1.2PCR扩增:25μL反应体系:灭菌ddH2O18.3μL;10×PCRbuffer(Mg2+)2.5μL;dNTP(2mM)2.0μL;上游引物(10pmol/μL)0.5μL;下游引物(10pmol/μL)0.5μL;;模板(30ng/μL)1.0μL;Taq酶(2.5U/μL)0.2μL。反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，35个循环;最后72℃延伸10min。PCR试剂为宝如亿(北京)生物技术有限公司产品。

1.3等位基因分离:2.5%的琼脂糖凝胶电泳分离产物，筛选出扩增效果好的产物进行STR扫描。共选取三种荧光标记，分别为FAM、HEX和TAMRA。

1.4数据统计分析:用GeneMapper4.0软件分析STR扫描结果，读取等位基因片段大小，通过PopGen1.32软件计算观测等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、F-统计量、Shannon信息指数、Nei遗传相似度及遗传距离等指标。在线软件GenePop对各位点进行Hardy-Weinberg平衡检验及杂合子缺失检验。PIC_CALC软件对每个位点进行多态信息含量(PIC)分析。

2结果与分析

2.1各微卫星位点在总群体上的遗传分布统计25个微卫星位点在两个豚鼠群体各个体的基因型，计算各位点的观察等位基因数、有效等位基因数、观察杂合度、期望杂合度、Shannon信息指数、多态信息含量、F-统计量，结果见表2。25个微卫星位点在两个群体中共发现121个等位基因，每个位点2～10个，平均4.84个。有效等位基因数在1.0812～7.0865之间，平均为3.148;观察杂合度在0.0781～0.8281之间，平均为0.4726;期望杂合度在0.0757～0.8656之间，平均为0.6070;Shannon信息指数在0.165～2.0572之间，平均为1.1702;多态信息含量(PIC)在0.072～0.843之间，平均为0.552。

2.2两群体遗传多样性比较如表3所示，A群和B群分别检测到103和116个等位基因;平均观察杂合度分别为0.4467和0.5062;平均期望杂合度分别为0.5195和0.5838;平均多态信息含量分别为0.459和0.518。可以看出，B群的豚鼠群体遗传多样性稍大于A群。

2.3Hardy-Weinberg遗传平衡检验本研究采用马可夫链法［17］计算两个群体每个位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验的精确P值［P(HWE)］、杂合子缺陷P值［P(ht．def)］与杂合子过多的P值［P(ht．exc)］，并计算相应的Fis(W＆C)和Fis(R＆H)，结果见表4。A种群有5个位点显著偏离Hardy-Weinberg遗传平衡［P(HWE)＜0.05］，偏离平衡的这5个位点中有4个表现出杂合子缺陷［P(ht．def)＜0.05］;B种群有6个位点显著偏离Hardy-Weinberg遗传平衡［P(HWE)＜0.05］，偏离平衡的这6个位点中有5个表现出杂合子缺陷［P(ht．def)＜0.05］。

2.4群体间遗传关系遗传分化系数(Fst)和遗传距离结果见表2。两个群体25个位点的Fst范围从0.0043到0.4656，平均为0.1056。两群体的Nei’s(1972)遗传距离和Nei’s(1978)无偏遗传距离分别为0.3302和0.3204。

3讨论

3.1两个封闭群豚鼠遗传多样性有效等位基因数是基因纯合度的倒数，反映了等位基因的相互影响，可作为群体遗传变异的一个指标。杂合度或群体平衡状态是群体遗传结构分析最直接和最有效的方法，杂合度值越高所在群体的遗传多样性就越丰富，较理想的封闭群体的杂合度值应介于0.5～0.7。多态信息含量是表示微卫星座位多态性高低的一个指标。当微卫星座位PIC＞0.5时，表明该遗传标记具有高度的可提供遗传信息性，为高度多态性座位;当0.25＜PIC＜0.5时，表明该遗传标记能够较为合理的提供遗传信息，为中度多态性座位;当PIC＜0.25时，表明该遗传标记可提供的遗传信息较差，为低度多态性座位。本研究中，A种群豚鼠在12个位点上呈高度多态性，在8个位点上呈中度多态性，在5个位点上呈低度多态性，平均多态信息含量为0.459，为中度多态性种群;B群豚鼠在12个位点上呈高度多态性，在12个位点上呈中度多态性，在1个位点上呈低度多态性，平均多态信息含量为0.518，属于高度多态性种群。通过以上数据可以看出B群豚鼠多样性略高，这与理论相符，可能与A种群豚鼠引种较早，并且群体不够大有关。A群豚鼠自1994年引种至今已有20年，其杂合度变化可能有以下4种原因:(1)管理失误:饲养管理不当、缺乏专业人员的监督和管理等人为失误是引起群体遗传特性改变的一个因素;(2)引入其他种群动物:封闭群动物的繁育采用封闭的方式，引入其他种群动物，也会引起遗传组成发生变化;(3)繁殖交配方式改变:封闭群动物的繁育中应避免近亲交配的出现，可通过最大避免近亲法、循环交配法或数量足够大时用随机交配法以避免近亲交配;(4)群体大小:为保持封闭群动物的遗传异质性，引种动物的数量要足够多，小型啮齿类封闭群动物引种数目一般不能少于25对。根据Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果，A种群豚鼠在5个位点显著偏离遗传平衡，B种群豚鼠在6个位点显著偏离遗传平衡，并且两个种群偏离平衡的位点，大多表现为杂合子缺陷。导致这一现象的原因除了无效等位基因之外，大部分的偏离可能是在饲养繁殖过程中未能实现随机交配，近交程度有所升高导致的。实验动物封闭群Hardy-Weinberg平衡偏离现象似乎是其繁殖过程中经常出现的一个问题。目前由于封闭群动物普遍缺乏相应的遗传监测，因此在繁育过程中要遵守严格的操作程序以避免近交现象，同时，通过定期的遗传检测对其生产管理及繁殖方式等作出评估及调整是必需的。

3.2两个封闭群豚鼠遗传关系Fst是种群之间遗传差异的一种测度。F-统计量计算结果表明，两个种群在25个微卫星位点的平均Fst为0.1056，即群体间的遗传变异占总遗传变异的10.56%，89.44%的遗传变异来自群体内部的遗传多样性。依据遗传分化指数Fst的解释(介于0－0.05之间说明种群间分化很弱，0.05－0.15之间表示中等分化，0.15～0.25之间表示分化大，大于0.25表明分化极大)，说明两群体间的遗传分化已达到中等水平。遗传距离以两个群体间同一座位上相同等位基因的频率差异的函数来测定，被用以描述群体的遗传结构和品种间的差异。两群体的Nei’s(1972)遗传距离和Nei’s(1978)无偏遗传距离分别为0.3302和0.3204，说明两群体间的亲缘关系较近。本研究利用25个微卫星标记对两个种群封闭群豚鼠的遗传检测表明，两个种群均符合封闭群动物的群体遗传特征，遗传分化处于中等水平，B种群的多样性略高于A种群。Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果提示种群的繁殖过程中有不同程度的近交现象存在。本研究结果可为封闭群豚鼠遗传检测方法和标准的建立提供基础资料。

作者：李芳芳魏杰王洪岳秉飞单位：中国食品药品检定研究院