小动物内镜在体成像应用探讨范文

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摘要：目的目前小鼠肠道病变监测需处死小鼠取病变组织。本文的研究目的是探索一种安全有效的方法，即构建小动物成像平台，来实现对肠道病变的在体监测，实现对同一小鼠的纵向研究。方法根据电子内镜成像原理搭建小动物成像平台。选取6只Balb‐c小鼠分别给予3%葡聚糖硫酸钠或生理盐水自由饮用，监测小鼠生理状况并利用内镜系统观察肠道黏膜损伤。结果所有小鼠均在麻醉状态下进行内镜检查，进境深度可达3cm，且无内镜相关并发症发生。内镜下可见葡聚糖硫酸钠组小鼠肠道病变逐渐加重。结论小动物结肠内窥镜可对肠道黏膜进行清晰成像，实现病变的在体评估，此外还可用于对其他干预措施的疗效监测。

关键词：小动物结肠镜；溃疡性结肠炎；葡聚糖硫酸钠；小鼠动物模型

人体内窥镜检查是医生检查肠道炎症或肿瘤变化的有效方法。在医学和免疫学研究中，肠道疾病的动物模型在临床前研究中扮演重要角色，成为研究肠道粘膜免疫系统、结肠炎和癌症发展的关键工具。但由于动物体积较小，很难对其实现准确评估。如溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)，一种主要局限于大肠黏膜和黏膜下层的慢性复发性非特异性肠道炎症性疾病，目前对模型的有效评估仍依赖于疾病活动指数（DAI）评估和体外组织病理学监测。DAI评分主要通过对小鼠的体重，大便性状和隐血情况的观察进行评分，在一定程度上受主观性影响；病理学监测均需处死小鼠取相应组织进行离体分析。故该方法存在以下缺陷：①无法实现病变的纵向观察，实现在体动态监测，缺乏可重复性；②主观个体差异及鼠间差异性影响结果准确性；③增加了研究的成本。此外化学诱导结肠癌模型（如偶氮氧甲烷(azoxymethane,AOM)和1,2-二甲肼(1,2-dimethylhydrazine,DMH)在结直肠癌研究中得到广泛应用[1]，用于早期致癌事件和评估潜在治疗方法的研究，但模型构建周期长达30周，优化后通过致癌药物联用（如AOM/DSS，AOM/DMH），虽然缩短了诱导时间，但至少也需要10周[2]。长时间的诱导及小鼠个体差异，很难在体确定每只小鼠肿瘤数量和生长动力学的相关问题。虽然目前已有用于小鼠的无创成像技术，如正电子发射断层扫描和磁共振成像[3]，它们使研究者能够在肿瘤研究的每个所需时间点进行实时观察。然而，这些方法成本高、耗时，并且仅能提供不精确的肠道视图。本文的研究目的是为了寻找一种安全、经济、有效的方法，用于对小鼠肠道进行清晰成像，动态监测肠道病变，实现对小鼠的纵向研究。该成像技术应具有安全性，可行性和可重复性等特点。故本课题组自行组装软式小动物结肠内窥镜，并对该设备在小鼠模型中的应用进行探索研究。

1材料和方法

1.1材料

Balb‐cnu/nu小鼠（6‐8周，体重约18‐20g），购于维通利华实验动物中心；葡聚糖硫酸钠（分子量36000‐50000），购自华美试剂公司，配置为3%水溶液；麻醉剂（5%氯胺酮+1%甲苯噻嗪）。

1.2设备构建

依据电子内镜成像原理利用光源、信息处理器（主机）、视频显示系统（图像采集）、内镜、辅助配件五部分搭建小动物内窥镜成像系统。

1.3方法

1.3.1溃疡性结肠炎模型构建

取6只小鼠，进行编号后，采用随机数字表法将其随机分为对照组和实验组。实验组自由饮用3%DSS水溶液，对照组给予蒸馏水饮用，连续饮用15d。

1.3.2内镜下监测

内镜操作前对成像探头进行水润滑，小鼠进行麻醉，麻醉剂使用方法为氯胺酮100mg/kg+甲苯噻嗪10mg/kg腹腔注射。待小鼠麻醉后，进行进境操作，平均进境深度约3cm。根据UCEIS[4]评分标准进行内镜下评分，包括血管模式（血管分布正常1分；血管结构模糊2分；血管闭塞或消失3分）、出血情况（无出血1分；可见陈旧性出血，用水冲洗后无血迹2分；可见血迹，用水冲洗后可见渗血3分；活动性出血4分）、糜烂和溃疡（黏膜正常1分；黏膜粗糙、糜烂2分；可见浅表性溃疡，表面覆白苔3分；可见溃疡，且深度较深4分）。实验结束后，处死小鼠，取远端结肠组织行病理学检查。根据Dieleman评分标准[5]进行组织病理学评分，评分标准见表1。

1.3.3数据分析

利用SPSS15.0软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。

2研究结果

2.1设备示意图

小动物内窥成像设备示意图，该系统主要依赖于镜身前端装备的成像设备进行图像采集，经图像传感器将光学信号转换为电子信号，后经图像处理器对信息进行处理后显示在监视器的屏幕上。成像探头外直径1.9cm，成像前端角度可自由调节。

2.2内镜及病理学评估：内镜下动态观察小鼠肠壁黏膜变化。对正常肠壁黏膜组织进行内镜下观察可见明显的血管分布和走行（图2A）。第7天，血管走行紊乱，黏膜发红，粗糙呈颗粒状，肛门处病变最明显（图3B）。第10天，肠壁黏膜血管走行模糊、紊乱，多处可见血迹，局部黏膜有坏死。造模第15天，肠壁黏膜脱落且部分肠壁附着有脓性分泌物（图2D）。15天后处死小鼠，取远端结肠组织行HE染色，3A、3B为小鼠肠道离体组织。病理结果显示正常结肠组织HE染色，可见结肠黏膜上皮组织完整，结构清晰，上皮细胞排列整齐，腺体完整。DSS组可见黏膜广泛缺失，腺体多数不完整，隐窝急性炎细胞浸润，呈典型炎症改变，黏膜表层糜烂，可见溃疡形成（图3D）。对肠道病变分别进行内镜下及病理学评分，结果均显示随着DSS饮用时间的延长评分逐渐增高，内镜下评分与组织病理学评分结果具有一致性。

3讨论

在临床应用中，内镜下监测联合病理学检查可实现对患者肠道病变情况进行在体评估。但对于研究动物而言，虽然目前动物肠道炎症及肿瘤模型构建方法存在多种，如化学药物诱导型、基因型、细胞移植型、自发性动物模型[6-8]。但由于小鼠体积较小，对肠道病变进行有效评估的唯一方法即处死小鼠取病变组织进行病理学分析。因此，适用于小动物水平的内镜系统的研发对动物水平在体研究具有重要意义。国外已有研究者对可用于小动物在体成像的内镜设备进行了研究，实现了动物水平肠道内窥成像，但国内仍缺少相关领域的研究。故本课题组根据内镜成像原理，自行搭建小动物成像平台，并对其应用进行了探索研究。溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)具有癌变倾向，且该病发病率和患病率在我国有明显增加趋势[9-11]。本研究通过自由饮用3%DSS构建肠道炎症模型，通过小动物结肠内窥镜系统对小鼠肠道进行纵向观察，研究结果表明该内镜系统不仅可实现肠道黏膜进行清晰成像，对小鼠肠道黏膜病变进行纵向观察，完成UCEIS评分，而且可以在可视情况下进行重复性操作。与传统评价疾病活动程度或肿瘤生长情况的方法相比（如体重、血便、血液分析、处死后离体组织学分析）具有明显的优势。首先，纵向观察很好的形成自身对照，减少了鼠间个体差异，同时也有利于选择最佳个体，进行更好的动物实验研究。此外，可有效降低研究成本。最重要的是，可依据内镜评价标准对肠道病变内镜下成像进行客观评价。与现有的其他应用于小动物的成像设备相比具有以下优势：（1）多数研究[12-13]使用的均为硬式内镜，存在进境距离受限及操作难度高等缺陷，该系统采用软式内镜成像探头，与现有的硬式内镜相比，能有效调节进镜角度和距离，增加进镜深度，降低操作并发症的发生；（2）活检探头直径小，可对小鼠进行多种操作，如肠道疾病的纵向动态监测、经腹进行腹腔操作如观察腹腔内器官病变情况、肝肿瘤模型构建等；（3）研究与辅助通道配套的相关零件设备后，可通过辅助通道实现肠道肠道内给药、在体活检等多种操作。随着成像技术的发展，多模态成像成为重要的发展方向之一。MitsunagaM[14]应用的设备可结合荧光探针进行荧光成像，提高病变的检出率。ShaoP[15]将高分辨显微内镜（high-resolutionfiber-opticmicroendoscopy，HRME）成像技术与基于光纤的光声内镜（fiber-based,real-timeC-scanoptical-resolutionphotoacousticmicroscopy，F-OR-PAM）结合构建新型内镜成像系统对小鼠耳部血管和人口腔黏膜同时进行荧光成像和光声成像，用于检测毛细血管结构及组织细胞。多种成像模式的结合，具有提高成像效果的作用。因此该设备仍存在成像模式单一的缺点，在未来还有待进一步的优化。

作者：张娜1；高健翎2；屈亚威2；贾馥华2；刘海峰2 单位：1.安徽医科大学武警总医院临床学院，2.武警总医院消化内科，北京